RNAi技术应用的研究进展

··技术与方法BIOTECHNOLOGYBULLETIN

2011年第7期RNAi技术应用的研究进展

张俐

（云南省科学技术情报研究院，昆明650051）

摘要：RNAi（RNAinterference），dsR-即RNA干扰是由与靶基因同源的内源或外源双链RNA（doublestrandedRNA，

NA）所引发的一种在动植物中普遍存在的基因沉默现象。它最早在植物体中被发现，现在已发展成为一种生物技术，并成为医学、药学和植物学等领域的研究成果进行综述。了后基因时代的重要研究手段。对RNAi技术在生物基础、

关键词：

RNAi

后基因组

功能基因组

ResearchProgressandApplicationofRNAInterference

ZhangLi

（YunnanAcademyofScientificandTechnicalInformation，Kunming650051）

Abstract：

RNAinterference（RNAi），causedbyendogenousorexogenousdouble-strandedRNA（dsRNA）withthesamesourceas

targetgenes，referstophenomenonofgenesilencingwidelyexistinginanimalsandplants．Itisoriginallyfoundinbodiesofplant．Nowithasdevelopedintoakindofbiologytechnologyandanimportantresearchinstrumentinpost-genomeera．ThispapersummarizedtheachievementsofstudiesonRNAitechnologyinbiology，medicine，pharmacy，botany，andotherfields．

Keywords：

RNAinterferencePost-genomeFunctiongenesgroup

1RNAi的发现

19年，Matzke等［1］首次报道了启动子介导的

在多种生物中存在，如线虫、果蝇、斑马鱼、真菌以及

生物体可利用RNAi来抵御病毒的感染，阻植物等，断转座子的作用

［5］

序列同源性基因共转染烟草，可引起转基因表达发Napoli等生沉默的现象。1990年，

［2］

。

把已知色素基

2RNAi的定义

目前对RNAi的定义有很多种，不同的资料对

因置于强启动子后，导入矮脚牵牛花中，试图加深牵

结果却发现花的颜色全部或部分变白。牛花的颜色，

（co-suppression），该现象在当时被称为“共抑制”即

导入基因后，该基因和牵牛花内源的着色基因都被抑制了。1995年，康奈尔大学的Guo等

［3］

如果将RNAi看作一其定义的侧重点也不尽相同，

种生物学现象，可以有以下定义：（1）RNAi是由双

由特定酶参与的特异性基因沉默现链RNA介导的、

象，它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基

以外因的表达；（2）RNAi是有dsRNA参与指导的，源和内源mRNA为降解目标的转基因沉默现象，具

有核苷酸序列特异性的自我防御机制，是一种当外源基因导入或病毒入侵后，细胞中与转基因或入侵病毒RNA同源的基因发生共同基因沉默的现象。RNAi这种现象已被证实在植物中广泛存在，它可能是生物的发育及抗外源或内源侵染的一种普遍机制。2002年，该发现被Science杂志评为十大科技突破之一。

尝试用反

1基因表达，结果发现反义RNA去阻断线虫的par-义RNA的确能阻断目的基因的表达，但作为对照的正义RNA，虽不能与活性RNA结合，也照样能引发Fire抑制。1998年，

［4］

——正将双链RNA（dsRNA）—

结果出现了比义链与反义链的混合物注入线虫后，

单独注入单链要强得多的沉默，并且导致子一代同（即源基因的沉默。这种现象被称为“RNA干扰”RNAi，RNAinterference）。同时，这也是人们第一次RNAi现象对RNAi技术的应用。随后的研究发现，

收稿日期：2011-01-06

mail：24872537@qq．com作者简介：张俐，女，硕士研究生，助理研究员，研究方向：科技查新及项目申请管理；E-

2011年第7期张俐：RNAi技术应用的研究进展

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如果将其作为一门生物技术，则可以定义为：（1）RNAi是指通过反义RNA与正链RNA形成双链RNA特异性地抑制靶基因的现象，它通过人为地引入与内源靶基因具有相同序列的双链RNA（正义RNA和反义RNA），从而诱导内源靶基因的mRNA降解，达到阻止基因表达的目的；（2）RNAi是指体外人工合成的或体内的dsRNA在细胞内特异性的将与之同源的mRNA降解成21－23nt的小片段，使相应的基因沉默的技术；（3）RNAi是将与靶基因的mRNA同源互补的dsRNA导入细胞，特异性地降

从而产生相应的功能表型缺失的技术，解该mRNA，

transcriptionalgene属于转录后水平的基因沉默（post-PTGS）。silence，

各种不同定义虽然说法不同，但所描述的事实即RNAi就是指由dsRNA介导的基是大体相同的，因沉默现象。

RNAi技术发展迅速，在生物学基础、医学、药学术，

和植物学等很多领域的研究均得到较大发展。4.14.1.1

RNAi在基础学方面的研究

真核细胞基因功能的研究随着基因测序

技术和生物信息学的不断发展，果蝇、线虫、水稻、小

鼠和人类基因组测序已经完成，而基因功能的研究步伐却相对缓慢。与传统的基因功能研究方法（如RNAi技术是一基因敲除、反义RNA技术等）相比，

种高效、特异、快捷和成本相对低廉的基因功能研究可以在RNA水平部分阻断手段。利用RNAi技术，某基因的表达，获得功能性丧失，进一步研究相关基因的功能。Dunn等

利用RNAi技术针对海葵肌动蛋白和半胱氨酸蛋白酶这两个基因，用原位杂交的方法证实这两个基因的表达均受到抑制，进而研究该基因的功能。4.1.2

信号转导通路的研究

利用RNAi技术可

以容易地确定复杂的信号转导途径中相关基因的上

［8］

下游关系及其作用。James等应用RNAi技术研究了果蝇细胞系中胰岛素的信号传导途径，取得了与已知胰岛素信号通路完全一致的结果。另外，基因组范围的RNAi表型筛选已成为研究基因在特殊细胞功能和生物活性中作用的一种有效方法，但对于相关基因之间的相互关系还是不能确定。

4.1.3其他基础研究除了以上两个主要应用方RNAi技术还被应用于生理学、面外，生长发育过程

［9］

等方面的基础研究中。Palmer等利用RNAi技术进行动物细胞离子通道生理学的研究和应用。4.2RNAi在医学方面的研究4.2.1

传统的建立人

LoxPsys-类疾病动物模型是利用基因敲除和Cre-的话，这些方法就会受到很大的。RNAi技术将是建立转基因动物模型的新的工具，随着该技术的发展，它可以通过使组织特异的基因功能灭活，不再需要条件定向小鼠和组织特异重组小鼠，因而转基因动物将是使用更加广泛的生物研究工具

［10］

［7］

3RNAi的分子机制

RNAi的过程可能包括起始和效目前研究认为，

应两个阶段。在起始阶段，加入的小分子RNA被切割为21－23nt长的小分子干扰RNA片段（smallin-terfering，RNAs，siRNAs），其中一个称为Dicer的酶，是RNaseⅢ家族中特异识别双链RNA的一员，它能以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因、病毒感染等各种方式引入的双链RNA，将RNA降解为19－21bp的双链RNAs（siRNAs），每个片段的3'端都有2个碱基突出。在RNAi效应siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓阶段，

RNA诱导沉默复合物（RNA-inducedsilencingcom-plex，RISC）［5］。激活RISC需要一个ATP将小分子RNA解双链的过程，激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上，并在距离siRNA3'端12

［6］

个碱基的位置切割mRNA。尽管切割的确切机制尚不明了，但每个RISC都包含一个siRNA和一个不同于Dicer的RNA酶。另外，还有研究表明，含有启动子区的dsRNA在植物体内同样被切割成21－23nt长的片段，这种dsRNA可使内源相应的DNA序列甲基化，从而使启动子失去功能，使其下游基因沉默。

利用RNAi建立疾病模型

tems方法，但是如果目的基因是小鼠发育必需基因

。

遗传基因工程小鼠已被广泛用于建立人类癌症

模型，模型小鼠模拟人类癌症相应的形态学，组织病理学、表型和基因型。这样的疾病模型对于分析特殊癌症基因和修饰基因的作用、评价常规癌症治疗

4RNAi技术的应用现状

近年来，作为一种高效、特异性强的基因阻断技

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生物技术通报BiotechnologyBulletin

2011年第7期和新药、鉴定癌症肿瘤生长标记、分析肿瘤微环境对肿瘤形成的影响、定义潜伏期和肿瘤发展分期等都优于传统的转基因的疾病模型。目前，乳腺、胰腺、肠、结肠和前列腺癌症的基因工程小鼠模型已经构建，而脑、卵巢、颈和皮肤癌症模型正处于研究的初

［11］

期阶段。RNAi除了被用于建立癌症疾病模型外，也用于其他疾病模型的建立和保护方面。Shcherbata［12］

等利用遗传和RNAi诱导果蝇细胞激化和肌营

［13］

养不良表型；Kim等构建重组体慢病毒将shR-NAs定向转移到保守的柯萨奇肠道病毒序列中，用于防治病毒性心肌炎，提高病毒性心肌炎动物模型

细胞中CML66的表达后发现HeLa细胞的增殖、侵

袭和转移能力受抑，进一步研究其机制发现CML66MMP15、uPAR、VEGF、COX-表达受抑后cathepsinL、S100A4、MUC1、MDM2和RAC1均下调，2、从而推断出CMI66作为致癌基因通过多途径促进肿瘤的增殖、侵袭和转移。

应用RNAi技术对肿瘤侵袭与转移的发生机制及有关基因的改变进行研究，有助于加深理解恶性

［19］

肿瘤的生物学本质。Shin等通过RNAi技术敲1表达，从而调节血管细胞黏附分子1除eaveolin-（VCAM-1）的表达，1的肿瘤细使得依赖于VCAM-［20］

胞的黏附显著受抑；Tsuchiya等通过RNAi制备Id1、Id3（InhibitorofDNAbindingproteins，Id）双倍敲

Id3的敲除显著除的胃癌细胞系MKN45，证实Id1、抑制胃癌细胞腹膜转移。Jiang等通过RNAi抑

MB-231和MCF-7中MTA1基因的表达，从制MDA-结果使这两株乳腺癌细胞的侵而下调ERα的表达，

袭活性下降。

Wang等［22］设计了针对目前所知的最强另外，——生存素（survivin）表达的的凋亡抑制因子—

RNAi，导入人食管鳞状上皮细胞癌细胞系KYSE510中，证实下调survivin可以强烈抑制体内和体外癌细胞生长，推测这种抑制可能是通过诱导凋亡的增强。该研究可加深对食管癌发生机制的了解，而且说明survivin可能是治疗食管癌潜在的靶位点，RNAi具有潜在的治疗价值。目前国内利用RNAi抑制survivin的表达在胰腺癌、宫颈癌、肺癌、大肠癌、神经母细胞癌、骨肉瘤细胞和白血病细胞中均有研究，不过大部分还停留在体外研究阶段。4.3RNAi在药学方面的研究

利用RNAi进行药物研究利用RNAi能够特异高效地抑制基因表达，获得去基因功能表型，能够在短时间内大规模筛选靶点，从而实现了在细胞水平

［23］

和动物水平筛选药靶和评定药靶。Hamami-chi［24］利用RNA干扰，系统屏蔽帕金森病模型中将近900个候选基因和通路，找到了两个帕金森病遗传易感性位点和治疗靶点，从而为该疾病的治疗奠定基础。

RNAi在被广泛应用于功能基因组研究确定了大量潜在的药物作用靶点的同时，也被证实其作为

［21］

的成活率。但是利用RNAi建立的疾病动物模型的

性状持续时间不太长，而且不一定能被稳定遗传，还有其他问题有待继续研究。

4.2.2RNAi抗病毒治疗目前，RNAi在抗病毒中诱发特异的mR-的研究主要是设计相应的siRNA，NA降解，从而发挥有效的抗病毒作用。美国麻省理工大学（MIT）的Novina最早开展了利用RNAi抗HIV的研究，开启了利用RNAi治疗病毒性疾病的先河。随后，又有学者参与到这个研究中来，他们针对HIV生活周期的不同阶段设计了多种siRNA，针

tat、rev和nef等基因的siRNA可用对HIV病毒gag、

以控制病毒复制。研究证实针对病毒基因组的gag

，区域的siRNA可以有效的将病毒的基因“沉默”抑

［13，15，16］

。此外，制HIV病毒的复制能力还有人开展

SARS了RNAi针对其他病毒，如呼吸道合胞病毒、

病毒、脊髓灰质炎病毒等的作用的研究，如用脊髓灰

质炎病毒基因组的siRNA处理人类和鼠的细胞，可明显减少子代病毒的数量，并能促进病毒从感染细

［17］

胞中清除的速度。4.2.3

RNAi在肿瘤治疗中的研究

RNAi技术具

有高效沉默特定靶基因的特点，在确定单个基因在肿瘤发生发展中的作用以及探索肿瘤的基因治疗方面是一种强有力的研究工具，因此其应用十分广泛。原癌基因的活化和/或抑癌基因的失活会导致肿瘤的发生，基于RNAi技术在单基因研究中的优势，利用RNAi抑制肿瘤细胞内的癌基因和抑癌基因的功能表达，分析其表型变化，有利于揭示肿瘤发生发展的分子机制，从而为肿瘤的诊断和治疗提供

［18］

标记物和治疗靶点。Wang等用RNAi干扰HeLa

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新一代基因治疗药物的可能性。2006年，美国Acu-ity制药公司生产的用于治疗湿性老年黄斑病变的RNAi药物———Bevasiranib在RNAi临床试验方面

它在疗效、安全性方面都优于常规药物。取得成功，

除Acuity制药公司外，另有两家公司也在进行RNAi

药物的开发，一是AlnylamPharmaceuticals，他们开发的RNAi药物用来治疗呼吸道合胞病毒、流行性感冒、帕金森病和高胆固醇血症等；二是SirnaTher-apeutics，他们开发治疗ADM的RNAi药物Sirna-027已经进入I期临床。其他方面的应用如治疗Huntington病和哮喘以及COPD也进入临床前研究阶段。但是RNAi药物仍存在如给药途径、使用安全性等方面的问题（信息来源于互联网http：//www．ganbaobao．com．cn/html/33/t-339333．html）。4.4

RNAi在植物学方面的研究

RNAi现象首先是在植物研究中发现的，因此RNAi技术在植物方面的应用研究也比较深入，包括植物功能基因组的研究、植物生长发育的研究、植物抗病性方面的研究和植物改良方面的研究等多个［25］

领域。4.4.1

植物功能基因组的研究随着后基因组时

代的到来，人们越来越需要大规模、高通量地研究基

在农业不育是高等植物生命活动的一个常见现象，

［29］

上有巨大的应用价值。Cigan等利用RNAi技术直接沉默玉米的花粉囊基因表达的启动子MS45，从

形成玉米的雄性不育株。利而抑制花粉囊的形成，

用RNAi技术可以创造一些优良的不育材料。Mori-toh等［30］观察OSGEN-L-RNA的水稻植株，发现一部分育性很低，一部分水稻雄性不育，找到了水稻的

雄性不育材料。

经济作物的作用成分含量增加或降低，可以提

［31］

高作物的经济价值和利用效率。张银波等利用RT-PCT技术克隆了油菜PEP基因片段并构建了对应于PEPASE基因的RNAi载体，以利用RNAi技术抑制PEPASE基因的表达，使代谢流偏向油脂合成，从而提高油菜籽粒中的油脂含量。另外，还有采用果实特异启动子结合RNAi技术抑制番茄内源光形

建成调节基因DET的表达，结果使再生植株中态，

DET1的表达下降，类胡萝卜和类黄酮含量明显升高，而果实的其他品质参数没有发生大的改变。这些均表明利用器官特异基因的沉默可以改善植物营

Shinjiro等［32］利用RNAi技术对控制养价值。另外，

咖啡因合成的基因进行抑制，使材料中的咖啡因含

量降低了50%－70%。

RNAi技术可针对植物的一些表型进行改良，这为人们生活增添了许多乐趣，也增加了一些植物更多经济价值；从另一层次来说，该技术丰富了植物的品种，尤其是对花卉品质的改良。日本生物研究所使用RNAi技术诱导花色和类黄酮生物合成的关键酶查尔酮合成酶（CHS）基因沉默，成功地将花由原来的蓝色变为白色和粉色，创造了新的商品花卉。澳大利亚和日本的研究者通过去除玫瑰中DRF基

［33］

因，培育出了世界上唯一的蓝玫瑰。这些都显示了RNAi技术在调节花卉的花色等观赏器官方面所具有的独特的经济价值。4.4.3

利用RNA介导的抗病性

机制，采用表达病毒来源的dsRNA是目前得到抗病

植物抗病性研究

因的功能。由于RNAi具有高度的序列专一性和有

效的干扰活力，可以特异地使某些基因沉默，从而获得功能丧失或降低突变。因此，它可以作为研究基因组学的一种有效工具。

在2002年11月，欧洲第五计划（theArabidopsisgenomicRNAiknock-outlineanalysis，AGRIKOLA）就已准备用RNAi技术来研究拟南芥所有基因（约

25000个）的功能，方法是利用拟南芥所有基因片段构建组成型和诱导型RNAi载体，通过农杆菌介导

［26］

转化拟南芥获得4000多个组成型hpRNA植株。Travella等［27］在构建的PDS-RNAi和EINI-另外，

RNAi的六倍体小麦转基因作物中，成功地抑制了目的基因。Lawrence等也曾用拟南芥着丝点甲基化相关的dsRNA，对拟南芥的四倍体进行RNA干扰，发现拟南芥的四倍体中对应的与甲基化有关的mRNA含量水平剧减。这些都可以证明RNAi技术是多倍体植物功能缺失突变很好的工具。4.4.2植物生长发育及新品种培育的研究

雄性

［28］

性转基因植株很有效的方法。许多研究者正通过此

技术进行植物抗病毒方面的研究，而其中应用最多的是利用农杆菌介导的转化将dsRNA整合到植物基因组中，然后检测转化体对病毒的抗性，或利用农杆菌瞬时转化系统，在dsRNA瞬时表达期间对植物

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生物技术通报BiotechnologyBulletin

2011年第7期体进行病毒感染检测，以确定dsRNA介导的病毒抗性的有效性。

当前已有大量关于RNAi技术用于植物病毒防

但技术还不是太成熟。首先，并不是治方面的报道，

所有的RNA序列都比较容易接近siRNA被识别、切

割，有些可能藏在高度折叠区而不易被siRNA识别。其次，病毒复制过程易发生突变，抗体往往无法长期对其发挥作用。另外，还需解决遗传稳定性方RNAi在植物病毒防治方面还应进面的问题。所以，

行更深入细致地研究。

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5小结

RNAi不仅能大大推动人类后基因组计划总之，

（蛋白组学）的发展，还在基因治疗、新药开发等医学和药学研究领域，以及植物品种改良，丰富物种多样性及提升植物经济价值等领域产生深远影响。尽RNAi技术还不管目前对RNAi的研究还不够深入，

够完善，但RNAi现象作为一种自然界普遍存在的生命现象，由其发展而来的RNAi技术必将在生命科学应用领域发挥重要的作用，其应用前景将十分广阔。

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