昆虫转基因研究进展_应用和展望

2004年　12月NewsletterofSericulturalScience

Ξ

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昆虫转基因研究进展、应用和展望

徐汉福

ΞΞ

　李　娟　刘　春　夏庆友ΞΞΞ

(西南农业大学蚕学与生物技术学院、农业部蚕桑学重点实验室　重庆北碚　400716)

摘　要　　自1982年Spradling和Rubin发现了可作为载体的P转座子并将外源基因成功地转入果蝇胚层系细胞的染色体而得到表达以来,昆虫转基因研究已经取得了长足进步。作为现代昆虫分子生物学中最为基本的技术之一,昆虫转基因技术不仅是分析昆虫基因功能的有力工具,而且在害虫防治、减少人类疾病载体昆虫携带的病原体的传播以及作为生物反应器等方面的作用亦日趋重要。

关键词　　昆虫转基因　转座子　转化标记　SIT　昆虫工厂

把遗传物质导入到昆虫基因组中是遗传学家和昆虫学家30多年来追求的重要目标。自1982年Rubin和Sprading利用P因子成功地转化出首例转基因果蝇后[1],转基因昆虫研究便

极大地引起了科学家们的兴趣。随着转基因技术的日趋成熟、一些不同类型转座子的发现和转化标记的不断发展,最近几年已有了多个比较成功的转基因昆虫的报道。本文综述了昆虫转基因研究的现状、进展及应用,并探讨了转基因昆虫研究的安全性、发展趋势和应用前景。

1　昆虫转基因研究现状

1.1　昆虫转座子

迄今为止,在昆虫中发现的转座子有P、Tc1、Pogo和FP等,近年来又发现了0、Hermes、mi2nos、hobo、mariner、piggyBac等昆虫转座子[2,3,4]。这里着重介绍一些在转基因应用中比较重要的昆虫转座子。1.1.1　P因子

果蝇P因子是最早发现的昆虫转座子之一,该因子是一种典型的真核生物转座因子,有自主性和非自主性两种。自主性因子使用P因子自身所编码的转座酶进行转移,其全长2.9kb,含4个外显子和3lbp的末端反向重复区(invertedterminalrepeat,ITR)。P因子内部的转录单位包括4个开放阅读框(ORF),编码分子量为87kD的位点特异性DNA结合蛋白,即转座酶,可识别P因子末端重复序列附近的10bp序列。P因子的切除和转座都需要转座酶参与,除转座酶外,P因子转座还需要宿主含有一个与P因子DNA上31bp反向序列结合的蛋白因子。P因子能够作为基因载体是基于外源DNA的插入并不影响其转座功能,在实际应用中,改造的P因子载体一般包含标记基因和两侧的P末端序列的质粒DNA,在含有完整的转座酶基因辅助质粒(helper)的帮助下,该载体就可被转座。P因子转座效率依赖于宿主的选择、载体的大小、DNA的浓度以及转导操作的方法等因素。目前只在黑腹果蝇和南美果蝇(Drosophila.willis2toni)中发现了自主性P因子[3,5],至于非自主性P因子,虽然其具有ITR,但转座酶基因被破

Ξ基金项目:国家自然科学基金项目(30330460,30270691)资助。

ΞΞ徐汉福,男,1978年12月生,博士研究生,研究方向:生物化学与分子生物学。ΞΞΞ通讯作者:夏庆友,1965年6月生,教授,博士生导师,研究方向:分子生物学。

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坏,故其应用价值不大。

最近A.Sarkar等[6]研究发现,在冈比亚按蚊(Anophelesgambiae)中至少有6个不同的P因子,在斯氏按蚊(Anophelesstephensi)、四斑按蚊(Anophelesquadrimaculatus)和白跗按蚊(Anophe2lesalbimanus)中也发现了类似于冈比亚按蚊中的P因子。进一步分析发现,在冈比亚按蚊中至少有两个P因子是完整的且具有潜在的功能,进化分析也表明按蚊中的这些P因子是来自于不同的进化枝。由此看来,除在果蝇属昆虫中有广泛的分布外,P因子很可能存在于果蝇以外的很多昆虫中,但其能否像果蝇中的P因子可作为高效的转座载体还需深入研究。1.1.2　PiggyBac转座子piggyBac(最初叫作IFP2)转座子来源于鳞翅目昆虫,最初是通过杆状病毒(Baculovirus)侵染粉蚊夜蛾(Trichoplusiani)TN-368细胞株系,从Galleriamellonella(GmMNPV)和Autographacalifornica(AcMNPV)核多角体病毒内首次分离得到的[3,7]。该转座子是一个自主因子,长2.5kb,含有1个RNA聚合酶Ⅱ启动子区和1个聚腺苷酸信号,该信号的侧面是1个开放阅读

框。piggyBac转座子的末端是长13bp的ITR,另外还不对称地分布着19bp长的内部反向重复序列。piggyBac转座子反向重复序列的5’末端以2～3个C碱基结束,3’末端的G碱基在切出位点的选择过程中起作用。由于piggyBac转座子总是在TTAA目标位点处插入,因而被归纳为特殊的TTAA可转移因子家族[8]。在粉红色螟蛉虫(Pectinophoragassypiella)胚胎[9]、家蚕(Bombyxmori)卵细胞[10]的切除测试等都表明piggyBac转座子能够准确地切除,在黑腹果蝇、黄色伤寒蚊(Aedesaegypti)、粉蚊夜蛾[4]和家蚕卵细胞内等的转座测试也表明piggyBac能够顺利转座,而且切除和转座的频率都较高。piggyBac转座子的准确切除总是伴随着转座,在转座时,能够把外源基因导入基因组中,并且能在新基因组中表达。研究发现,piggyBac转座子的转座不受物种和生殖种系的,携带的基因没有大小的,具有较广泛的适应范围。自发现以来,piggyBac转座子载体已经被用来转化了双翅目、鳞翅目、鞘翅目和膜翅目等很多昆虫。

家蚕作为对人类贡献最大的经济昆虫,其转基因一直倍受关注。但在家蚕转基因研究中,一直没有发现类似于果蝇P因子的高转座效率转座子,因此其转基因研究进展缓慢。直至1997年,终于发现piggyBac转座子对家蚕也有转座作用,随后研究人员利用piggyBac转座子进行了大量的家蚕转基因研究,并取得了较大进展[11]。2000年[12]和2002年[13],日本和法国的研究人员分别利用piggyBac转座子,以绿色荧光蛋白为报告基因,获得了稳定的转基因家蚕。2003年[14],日本研究人员又成功地获得了GAL4/UAS家蚕品系。国内目前利用piggyBac转座子开展昆虫转基因研究的报道很少,在家蚕转基因研究方面刚刚起步,本实验室在这方面的研究已有一定基础,预计在不久的将来将会获得转基因蚕。1.1.3　其他转座子

hobo来源于黑腹果蝇,是除P因子外应用较多的转座子,不局限于生殖细胞。已在黑腹果

蝇中建立了hobo因子的转基因系统,利用该系统进行黑果蝇(Drosophila.virilis)的转基因也取得了成功[15]。研究表明,hobo的转移频率虽然因昆虫种类而不同,却均显示了一定的活性[1]。目前hoho的转座机理尚有诸多不明之处,需进一步研究。

mariner是在黑腹果蝇的近缘种毛里求斯果蝇(Drosophila.mauritiana)中,作为引起不稳定体细胞变异的因子而被发现的[16],虽然黑腹果蝇中没有mariner,但是将mariner作为载体在黑腹果蝇中的转基因获得了成功。另外,Robertson和Lampe明确提出在许多昆虫中都有与mariner类似的因子。2004年,G.Kumaresan和S.Mathavan[17]研究发现家蚕中也有mariner-like转座

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子的分布,且有五种不同类型。所以,该转座子是否可作为应用广泛的转基因载体正受到大家的注目。

minos是从海地果蝇(Drosophila.hydei)中分离出来的,但在黑腹果蝇和地中海实蝇(Ceratitiscapitata)中没有发现[2]。该因子的转座作用可以突破种间,能用于黑腹果蝇的转基因载体。minos编码的转座酶可以在黑腹果蝇中表达,并可催化minos转座子精确地插入黑腹果蝇的基因组中,在地中海实蝇中转基因也已成功[18]。1.2　转化标记

要想有效地筛选昆虫转基因个体就必须在载体中装入标记基因。比较常用的标记筛选方法有将昆虫自然突变基因导入野生型个体和使用抗药性基因等方法,但均具有较大的局限性。通过研究人员的不断努力,目前已经建立了一套以多种荧光蛋白为基础的识别转基因昆虫的遗传标记系统,基本上能够满足转基因昆虫个体筛选的需要。1.2.1　眼色标记基因

以眼色突变体(如white)作为宿主导入目的基因,用正常型眼色基因作为标记基因和目的基因一起转入宿主,在子代中筛选具有正常眼色标志的转基因个体就比较容易。常用的眼色标记基因,是通过在混杂的眼睛中筛选得到的,这些基因的突变能造成明显的表现型,很容易与野生型相区分。携带这些眼色突变的昆虫常在实验室生存得很好,且这些基因都较小(2～3kb),因此,眼色基因作为转化标记是很合适的。在非果蝇昆虫中第一个有效的生殖系的转化就是利用眼色标记基因来鉴别转化子。地中海实蝇和黄色伤寒蚊的转化,很大程度上也是得益于此[2,19]。

眼色基因作为标记基因尽管具有个体易筛选、后代易存活等优点,但对许多重要的昆虫而言,因缺乏合适的受体突变系,从而使其利用受到。此外,突变系是近亲交配,其体质没有野生的强壮,这在转化实验中会造成成活率低,有碍于建立纯合的转基因品系。1.2.2　抗药性标记基因

事实上,最早找到的标记是能作用的抗药性基因。在冈比亚按蚊中,首次转化便是利用的细菌neo基因编码的新霉素磷酸转移酶II作为选择标记的,这种选择是基于对一种氨基糖苷类抗生素(Geneticin)的抗性,但因其不能有效重复而在伊蚊中的应用受到了。

Opd和rdl基因则只在黑腹果蝇中起作用[19]。在野生型昆虫中,对药物或抗生素有抗性

的种类很多,且由于染色体的位置效应,转化标记的表达水平在转化个体间也存在很大差异,因此,抗药性筛选易于出现假阳性或假阴性。在利用常规技术中,许多药物毒性也是我们不希望出现的,抗药性杀虫剂和抗生素的存在已经是一个影响人类健康的主要问题,若再利用抗药性转化标记基因的话,也许会加剧目前情况的恶化。1.2.3　GFP/荧光标记基因

理想的转化标记应该满足表达水平高、范围大、毒副作用小、便于检测等条件。目前研究得较透彻的标记基因是从水母中得到的编码绿色荧光蛋白(GFP)的基因,在此基础上发展的增强性绿色荧光蛋白(EGFP)基本满足了上述条件,成为新一代转基因标记,被广泛的应用于昆虫转基因研究。

EGFP有一个488nm的激发峰值,可以被无害的蓝光激发,其荧光强度野生型GFP高35倍[19]。EGFP在强启动子启动下能够快速可靠地检测转基因昆虫的单拷贝插入,因此在利用时常选用组合型及组织特意性启动子。实际应用的结果表明以EGFP为基础的标记甚至比眼

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色基因还要敏感且可靠得多。EGFP不但在以前利用眼色基因作为转化标记的一些物种中取

得了成功,而且在许多昆虫物种中也取得了成功,表明其具有广泛的应用前景。

2　转基因技术的应用

2.1　基因功能分析

昆虫转基因技术是分析基因功能的重要工具。要最终鉴定基因功能,最理想的方法是将分离的基因导入昆虫体内,在个体水平上验证其是否具有功能。特别是对于功能基因组学研究来说,不仅要确定序列的编码区和非编码区,还要鉴定相关的生物功能,因此只有转基因方法才能最终使我们认识所有的不同序列的功能特征。2.1.1　基因错误表达有些基因在细胞、组织或者不同时期通常是不活跃的,利用转基因技术可以研究某个基因在不同时期、不同组织中的表达或者某些基因在同一时期、同一组织中的表达,这是基因功能研究的一个有效途径。基因异位表达经常会有可以解释的表型结果,但这些结果多数是有害的,因此,需要有条件的诱导基因的错误表达,如利用热激诱导基因的条件启动子。最常用的能够热激诱导基因表达的昆虫启动子是果蝇的热激蛋白70(hsp70)启动子,利用该启动子已经在果蝇中完成了好几个这样的异位表达实验[20],目前在转基因家蚕品系中也获得了成功[21]。2.1.2　用RNAi进行基因敲除

作为传统遗传学的有力替代工具,RNAi能够使基因在转录后沉默,这大大改变了昆虫基因功能分析的手段。RNAi一般是通过将dsRNA显微注射到胚胎、幼虫或蛹中对基因功能进行分析,但dsRNA只能瞬时干涉基因的表达,因此RNAi不能稳定遗传。而转基因技术则可以避免这一不足,通过建立一个二元表达系统(两个单独的转基因品系),使其在一定条件下进行表达,产生发夹环状RNA,从而获得可遗传的效果,这样就可以研究更多昆虫的基因功能。2.1.3　筛选新的基因

用化学诱变方法筛选出的新基因不好获得其分子信息。一种新的以转座子为基础的非物种特异性的插入诱变和增强子检测方法最近已经发展起来[20,22],该方法依赖于两个因子:一个因子(起跳因子)编码转座酶以使第二个因子(突变因子)移动,在基因组上随机整合并引起突变,但这两种类型的转座子不能交叉移动。只要突变因子含有一个由基础启动子驱动的报告基因,插入诱变和增强子检测就能够同时应用到相同的筛选中。当突变因子在一个特殊的增强子附近整合时,基础启动子便会应答,报告基因将会在一个增强子的部分被启动表达,在某一时期或特定组织特别活跃的新基因就能够被识别出来。目前建立的一个以piggy2Bac转座子为基础的插入诱变和增强子选择系统,在黑腹果蝇中进行了功能验证[23]。这种方

法将序列数据直接和生物功能联系起来,因此是一个成功的昆虫功能基因组学研究的完整工具,应该能够应用于各种各样的昆虫物种。2.2　害虫防治

昆虫遗传防治是转基因昆虫应用的一个重要领域。用遗传方法防治害虫的观念是在本世纪40年代首先提出来的,之后F.Kripling和S.Serebrovsky提出了类似的方案:使同种昆虫的不育成员充满一个害虫种群,导致大多数交配不能产生正常发育的后代,而有害基因又可以通过少数有效的交配继续向后代转播。但其后进展不大,直到1968年,Curtis又重新发现了这个设想的价值,S.Serebrovsky的贡献才为人们所知[24]。现在,这种策略被称为不育昆虫技术(sterile

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传统的SIT通常是释放雌雄两种昆虫,但不育雌虫并不能抑制害虫群体,反而还会引起果实的破坏,另外,大量释放雌性昆虫可能会有很大的风险,因为在很多情况下传播疾病载体的往往是雌虫。经过不断完善,形成了新的SIT体系,它包括大规模饲养、不育和大量野外释放昆虫并与野生昆虫杂交从而使害虫群体数量显著减少,目前其在害虫防治中的作用日益重要。

SIT给害虫防治带来了性的观念。传统的害虫防治方法过多地依赖于有毒的杀虫剂,有时候很容易造成对非目标生物体的伤害,而转基因技术能减少对化学杀虫剂的依赖。现在一种新的能减少这种不良伤害的害虫防治策略已初步建立起来[25],它是以转基因昆虫表达的一种酶为基础,将不具活性的雌特异性前体药物转变成活性的有毒的形式,从而达到杀虫目的。目前已在果蝇中建立了这样的模型,即以转座子为介导将细菌的胞嘧啶脱氨基酶(CD)基因整合到果蝇的基因组,并在Yp1雌特异性启动子/增强子的下进行表达。该方法的应用有助于提高能进行大规模饲养和释放的昆虫害虫和疾病载体的控制,如农业害虫中的棉铃虫(Helicoverpaarmigera)、烟草天蛾(Manducasexta)、舌蝇(Glossinapalpalis)、家蝇(Moscadomesti2ca)等。

目前,已有不少学者利用GFP等标记,研究了在带有标记的转基因昆虫释放后,其在野外昆虫种群中的分布和扩散规律,其结果初步证实了通过转基因昆虫的SIT技术在害虫控制中的可能性。因此,认为SIT很有可能是第一个能在任何一个领域中应用转基因昆虫的技术,因为这里没有转基因的垂直传递。如果进一步的研究顺利,预计不久的将来第一批转基因昆虫将很快得到大规模释放。

3　转基因昆虫的安全性和存在的问题

转基因昆虫在很多领域都有重要的应用,尤其在害虫防治方面,但是转基因昆虫释放所带来的安全性等问题是不可忽视的。释放转基因昆虫可能带来的风险比较多,目前人们担心的问题可以归纳为以下几个方面:①转基因的种群是否稳定?②其寄主或捕食范围是否发生改变?③其在环境中的生存能力(地理分布和气候忍耐力)是否发生改变?实际上,在释放转基因昆虫时,人们对许多释放对象的扩散行为还知之甚少。转基因昆虫从试验释放点能扩散到多远的距离?扩散的速度怎样?与其它种类之间出现基因水平转移的可能性有多大?这些都是研究者们无法回避的现实问题。3.1　转座子不稳定性

稳定的转座子载体对于转基因昆虫来说是非常必要的,因为转化后的昆虫将被释放到环境中去,故要求其转化后的基因不会发生再次的遗传转移,才能保证昆虫种群的稳定。然而随着研究的不断深入,已经发现了一些转座子不稳定的例子。

目前Horn等[23]在果蝇和赤拟谷盗(Triboliumcastaneum)中发现了piggyBac转座子的整合后再次转移现象。他们建立了果蝇的转基因品系,其中一个品系含有一个具有增强子报告基因的非自主性piggyBac载体,其它品系含有Hermes,mariner或minos因子单一的插入并且具有由强启动子控制的piggyBac转座酶基因。通过报告基因和起跳因子品系的杂交诱导再次转移,并用新的报告因子检测后代。结果发现,平均约有80%的异质接合体产生的后代有转座事件,所有的转座事件是规范的剪切和粘贴重组反应。而在翅拟谷盗中,通过注射转基因品系的发育中的胚胎(该品系含有一个单一的具有唯一的报告基因表达模式3xP3EGFP的piggyBac

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因子)获得了重组源因子。

由于在转基因昆虫研究中,piggyBac转座子是目前应用广泛、稳定性高的转座子,如果上述不稳定现象的确存在,那么对于研究者来说这将是一个严峻的考验和挑战。尽管应用pig2gyBac转座子已经成功地转化了多种昆虫,但一旦将这些昆虫释放到野外,其对环境和相关物种带来的影响是难以估量的。

迄今为止,虽然还没有其它转化成功的昆虫转座子不稳定的报道,但类似于piggyBac转座子的情况是可能存在的,因此有必要对这些问题进行深入研究,以寻找并最终解决影响转座子不稳定的因素。3.2　基因水平转移转基因昆虫释放的另一个风险就是转基因昆虫与其它种类之间出现基因水平转移的可能性。比较基因组研究发现基因水平转移现象是普遍存在的,虽然经验表明“新的生物”在新的环境中定居的可能性很小,但大量释放转基因昆虫可能会增加基因水平传播的风险。

P因子已经在过去50年侵入到了黑腹果蝇群体,而其来源是南美果蝇群体[26]。另一个在种间进行基因水平转移的转座因子是mariner,它存在于果蝇科的Drosophila和Zaprionus属中[27]。Mariner因子仅出现在8个黑尾果蝇族中的5个族中,但却存在于Drosophila属以外的Zaprionus属中,而后者与前者亲缘关系较远。这两个属中的mariner因子的DNA序列相似性达97%,而它们的核基因Adh则相差较远,这说明存在着mariner因子的水平传播。此外,细菌共

生物也是昆虫种间基因水平传播的重要途径,例如在蚊子、果蝇和甲壳虫之间就存在共同的细菌共生物,而且进行了DNA的水平传播。另一个潜在的昆虫间DNA水平传播的载体是昆虫病毒[26]。所有这些因素都增加了转基因昆虫释放的风险。到目前为止,尚未见到大规模释放转基因昆虫成功的报道,尽管在小范围内成功释放的例子较多,但在害虫遗传防治项目中,需要重复大量地释放转基因昆虫。因此,对于复杂的害虫防治工程来说,在释放前解决上述问题极为重要。

4　展望

转基因技术可以实现昆虫功能基因的过量表达或者基因功能缺失,是研究昆虫基因功能的重要方法之一。继果蝇、冈比亚按蚊、烟芽夜蛾(Heliothisvirescens)、意大利蜜蜂(Apismellif2eraligustica)以及家蚕[28]等昆虫的基因组测序完成后,正在或者即将对更多的昆虫进行全基因组测序,这将大大促进昆虫转基因研究,拓展其范围和领域,使基因功能研究迈上一个新台阶。

昆虫遗传防治是转基因昆虫应用的一个广泛领域。利用转基因昆虫防治害虫,其防治对象是靶害虫而不是针对所有昆虫,这样既避免了农药防治的弊端,又能达到长期控制靶害虫种群的目的。随着分子生物学和基因工程研究的发展,其应用将会更加广泛。但应特别重视用于害虫防治的转基因昆虫的释放可能带来的风险,目前还没有明确的条款来指导和评价向环境中释放长期定植的转基因昆虫,因此有必要建立一套切实可行的评估体系,对转基因昆虫的种群稳定性及其生存、繁殖和分布,在群落中对其它种类的影响,释放的时机和布局等进行严格的评估;同时,应继续探索和研究外源基因在昆虫体内的作用机理,以降低乃至避免释放转基因昆虫可能带来的风险。

转基因技术是利用功能基因开发新的昆虫品种的关键,甚至还是实现利用昆虫合成有用蛋白质、开发生物反应器的技术关键。如利用转基因昆虫特别是绢丝腺昆虫作为生物反应器

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可以大量廉价地生产医药品等各种有用蛋白质,这种目前被叫做昆虫工厂的技术,可能会带来医药工业的,将是转基因昆虫研究的一个重要方向。家蚕具有适合大量生产特定蛋白质的绢丝腺,具有纯蛋白质的高效合成、高等真核生物的蛋白质后修饰加工、大规模生产成本低和对人畜安全等优点,被誉为最理想的生物反应器模式昆虫,有巨大的开发应用潜力。随着家蚕全基因组测序工作的完成和深入研究,将有助于阐明绢丝蛋白的分泌机理,突破工程蛋白实用表达效率和下游加工技术瓶颈,促进昆虫反应器的实用化。参　考　文　献

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PROGRESS,APPLICATIONSANDPROSPECTSOFINSECTTRANSGENESIS

XUHanfu　LIJuan　LIUChun　XIAQingyou

(TheKeySericulturalLaboratoryofAgriculturalMinistry,SericultureandBiotechnologyCollege

ofSouthwestAgriculturalUniversity,Chongqing400716,China)

ABSTRACT

Thelast20yearshavewitnessedgreatprogressininsecttransgenesissinceSpradlingandRubinfirstdemonstratedgerm-linetransformationinfruitfly,Drosophilamelanogaster,usingthetransposableele2mentP.Asoneofthebasictechniquesofmoderninsectmolecularbiology,genetictransformationofin2sectspeciesprovidesimportanttoolsnotonlyforfunctionalgeneanalysis,butalsoforeconomicandmed2icalapplications,suchasinsectpestmanagement,controlofpathogentransmissionbyhumandiseasevectorsandasbioreactors.

Keywords　　insecttransgenesis　transposon　transformationmarker　SIT　insectfac2tory