微生物对有机物降解及转化能力的定性分析

微生物对有机物降解及转化能力的定性分析

监测1035班 第二课堂第一组

组员：

摘要：

自然界中化学物质的降解一般可分为3种方式： 光降解、 化学降解及生物降解。 动物、植物和微生物能分解各种有机物，特别是微生物能通过它的代谢活动，发生氧化还原、脱羧基、脱氨基、加水分解、脱水、酯化等种种反应。因此，自然界化学物质的降解虽然常是上述3种方式交叉进行的，但其中与微生物降解作用的关系最大。

引言：

环境中存在的各种天然产物，特别是有机物，几乎都能找到可以使之降解或转化它的微生物。然而由于近几十年来许多人工合成的化合物，是自然界中原来所没有的。因此不可能存在有作用于它们能使之分解的微生物和酶系，甚至对微生物还有杀灭作用。 由于微生物个休小、繁殖迅速、比表面大等特点。它们较之其它生物更易适应环境，并可通过自然灾变产生新菌种，产生新的酶系统，具有新的代谢功能，从而可参与对人工新合成化合物的降解与转化作用。因此微生物对降解污染物具有巨大潜力。 例如已发现多种微生物对合成有机物的降解作用：  酚类已发现降解细菌有30个属，66种  卤素有机物降解细菌有27个属，40种

 合成含氮有机物降解细菌有18个属，36种  合成表面活生剂降解细菌有18个属，43种  石油烃类降解细菌有100多个属，200多种

一、材料与方法：

1.菌种：

枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、普通变形杆菌、产气肠杆菌 2. 溶液、试剂和仪器：

卢戈氏碘液、乙醚、吲哚试剂、甲基红试剂、无菌平板、无菌试管、接种环、试管架、滴瓶、滴管、无菌平板、无菌试管、接种环、试管架、滴瓶、滴管 3.培养基：

3.1蛋白胨水培养基的配制：

配方：蛋白胨10g，氯化钠 5g，水 1000mL，pH值7.6

制法：按上述成分配制,分装小试管,每管10ml，121℃高压灭菌20min。 3.2淀粉培养基的配制：

配方：蛋白胨10g，氯化钠5g，牛肉膏5g，可溶性淀粉2g，蒸馏水1000ml，琼脂15-20g

制法：先将可溶性淀粉加少量蒸馏水调成糊状，再加入到熔化好的培养基中调匀121℃高压灭菌20min。

3.3油脂培养基的配制：

配方：蛋白胨10g，氯化钠5g，牛肉膏5g，香油或花生油10g，中性红（16%水溶液）约0.1ml，琼脂15-20g，蒸馏水1000ml，pH值7.2

制法：按上述成分配制，0.1MPa下灭菌20min。

3.4柠檬酸铁铵半固体培养基的配制：

配方：蛋白胨20g，氯化钠5g，柠檬酸铁铵0.5g，硫代硫酸钠0.5g，琼脂5-8g，蒸馏水1000ml，pH值7.2

制法：按上述成分配制，0.1MPa下灭菌20min。 3.5葡萄糖蛋白胨培养基的配制

配方：蛋白胨10g，葡萄糖5g，K2HPO42g，蒸馏水1000ml，pH值7.0-7.2， 制法：按上述成分配制,过滤，分装小试管,每管10ml，112℃高压灭菌30min。

三、包扎与灭菌：

将配制好的培养基、培养皿以及所需的物品放入高压蒸汽灭菌锅内灭菌，注意物品不能放得太满，要平放，以免培养基倒出。

四、实验原理：

4.1甲基红（M.R）试验：

某些细菌在糖代谢过程中生成丙酮酸，有的甚至进一步被分解为甲酸、乙酸、乳酸等，而不是生成V－P试验中的二乙酰，从而使培养基的pH下降至4.5或以下（V－P试验的培养物pH常在4.5以上），故加入甲基红试剂呈红色。本试验常与V－P试验一起使用，因为前者呈阳性的细菌，后者通常为阴性。

4.2吲哚试验：

有些细菌可以分解色氨酸生成吲哚可以与二甲基氨基苯甲醛反应生成红色的玫瑰吲哚，因此可根据细菌能否分解色氨酸产生吲哚来鉴定菌种。

在培养液中加入乙醚1～2ml，静置片刻后乙醚层浮于培养液的上面，此时沿管壁缓慢加入5～10滴吲哚试剂(加入吲哚试剂后切勿摇动试管，以防破坏乙醚层影响结果观察)，如有吲哚存在，乙醚层呈现玫瑰红色，此为吲哚试验阳性反应，否则为阴性反应，阳性用“+”、阴性用“-”表示。

4.3乙酰甲基甲醇（V.P）试验：

某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养液中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中氧，氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称V－P（+）反应。

4.4淀粉水解试验

淀粉遇碘呈蓝紫色，在淀粉酶的作用下，淀粉可分解为遇碘不显色的糊精等小分子物质。

因而可以根据培养基再加碘液后颜色的变化来观察淀粉水解的情况。

4.5脂肪水解试验

脂肪是由甘油和各种脂肪酸组成的。某些种类的细菌能产生脂肪酶水解脂肪形成甘油和脂肪酸，脂肪酸与中性红结合形成红色斑点。脂肪酸也可以与重金属盐如硫酸铜反应形成浅绿-蓝色的沉淀。

4.6H2S产气试验

某些细菌能分解含硫有机物，如胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸等产生硫化氢，硫化氢遇培养基中的铅盐或铁盐时，会形成黑色的硫化铅沉淀。（也可在液体培养基中接种细菌，在试管棉塞下掉一块浸有醋酸铅的滤纸）

五、实验步骤

1． 淀粉水解试验：

融化培养基 → 无菌操作倒入15-20ml至平皿中 → 凝固制成平板 → 翻转平皿，使平皿底朝上贴标签 → 用接种环取少量谷草芽孢菌在平板的一边划“十”字，作阳性对照菌 → 另取少量大肠杆菌或产气杆菌在平板上、的另一边划“十”字 → 倒置培养，37℃，24小时。 2． 油脂水解试验：

融化培养基 → 充分振荡摇匀，使油脂均匀分布后 → 倒入平皿中凝固制成平板 → 翻转平皿，使使平皿底朝上贴标签 → 用接种环在平板上的一边接种金黄色葡萄球菌作阳性对照菌，另一边接种大肠杆菌或产气杆菌 → 倒置培养37℃，24小时

3． V.P试验（乙酰甲基甲醇）：

分别将大肠杆菌和产气杆菌接种于盛有 培养基的试管中，分别贴上标签 → 于37℃，24-48小时培养。 4． 吲哚试验：

分别将产气杆菌和大肠杆菌接种于盛有蛋白胨水培养基的试管中，分别贴上标签 → 37℃培养48小时。 5． 甲基红（M.R）试验：

分别将大肠杆菌和产气杆菌接种于盛有 培养基的试管中，分别贴上标签 → 37℃培养48小时。 6． H2S产生试验：

试用刺穿接种法，分别将大肠杆菌和普通变形杆菌接入盛有 培养基的试管中，分别贴上标签 → 于37℃培养48小时

六、观察结果

1．淀粉水解试验

在形成菌落的平板上滴加鲁哥碘液1-2滴，观察结果。在琼变脂平板上会出现变化。如有不变色的则表明淀粉已被水解。若变色则表明淀粉酶没有被水解。 2．脂肪水解试验

在平板上滴加中性红作指示剂，菌落下若有红点出现，表示脂肪已被水解

。或用饱和的硫酸铜溶液淹没油脂琼脂平板，使试剂与培养基反应15分钟，清去多余试剂，再静止约十分钟，如脂肪已被水解则菌落周围形成浅绿-蓝色。 3．乙酰甲基甲醇（V.P）试验 在试管内先加入40% KOH溶液10-20滴，然后再加入等量的萘酚

溶液，拔去棉塞，用力振荡，再放入37度恒温箱中保温15-30分钟（或在沸水浴中加热1-2分钟）如溶液出现红色，为V.P.阳性反应 4．甲基红(M.R)试验

沿试管壁加入甲基红指示剂3-4滴，若培养液变成红色即为阳性，变成黄色即为阴性。

5．吲哚实验

在培养液中加入如乙醚1-2毫升吗，充分振荡，使吲哚溶于乙醚中，静止片刻，使乙醚层浮于培养基的上层，然后沿试管壁加十滴吲哚试剂。如果有吲哚产生则乙醚层呈现玫瑰红色。 6．H2S产气试验

如培养基中出现黑色沉淀线者为阳性反应，同时注意观察接种线周围有无向外扩展

情况，如有表示该菌具有运动能力。

七、结果与分析

7.1实验结果记录：

表1大分子水解实验结果记录

淀粉水解 油脂水解 大肠杆菌 - + 枯草芽孢杆菌 + 金黄色葡萄球菌 - 注：有水解圈产生为阳性（+），反之为阴性（-）。

表2糖酵解实验结果记录

H2S 大肠杆菌 ++ 普通变形杆菌 -- “+”产酸或产气，“-”不产酸或不产气。

表3吲哚甲基红实验结果记录 甲基红实验 吲哚实验 V.P.试验 “+”为阳性，“-”为阴性。 7.2结果分析：

大肠杆菌 + + + 产气肠杆菌 - - - 由大分子水解试验可以得出枯草芽孢杆菌能产生淀粉酶脂肪酶的结论，枯草芽孢杆菌菌落周围的透明圈较大，可以大体判断前者较后者代谢利用淀粉的能力强。大肠杆菌能产生脂肪酶。

在吲哚试验中，大肠杆菌和产气肠杆菌都能具有分解色氨酸产生吲哚的能力。 硫化氢试验中，仅有变形杆菌产生了黑色物质。两支试管接种周围都有向外扩展现象。仅变形杆菌能分解含硫的氨基酸并产生硫化氢。两种菌均具有运动能力。

V.P试验中，说明大肠杆菌在葡萄糖蛋白胨水中代谢不产生乙酰基甲醇；产气杆菌产生了少量乙酰基甲醇。

7.3小结：

本次实验总体来讲较为成功，但应注意一下几个细节：

1）实验内容多，易混乱，所以在实验过程中一定要做好标记，且避免接错菌，造成混乱；

2）实验一定按照无菌操作的要求，避免杂菌污染。

3) 注意先加入3~4滴乙醚，摇动数次，静置后再加入2滴吲哚试剂，注意顺序，注意待乙醚上升后再滴加吲哚试剂，滴加吲哚试剂后要注意不要晃动，因为产生的玫瑰色靛基质本来就不多，如果剧烈晃动使之扩散开来的话，就基本上看不见了；

4)淀粉水解试验中，观察各种细菌生长情况时，滴入少量卢戈碘液于平板中，应轻

轻旋转平板，使碘液均匀铺满整个平板；

5）甲基红试验中，应该注意甲基红试剂不要加得太多，以免出现假阳性。

参考文献：

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