疾病蛋白质组学研究中选材与样品制备的策略分析

疾病蛋白质组学研究中选材与样品制备的策略分析

刘勇路名芝

[关键词]蛋白质组；样品；疾病分析[中图分类号]R365

1994年Wlliams和Wilkins两位学者首先提出

与基因组相对应的“蛋白质组”（proteome）概念，广义上指某一细胞或组织的基因组表达的所有蛋白质。蛋白质组学是近年来应用各种技术手段对蛋白质组进行综合分析的一门新兴学科，目前广泛应用于生命科学各个研究领域。目前蛋白质组学研究发展十分迅速，无论是理论还是技术都得到不断完善和突破，成为我们探索疾病病因、发病机制、判断预后及药物开发等的有力工具[1]。

蛋白质在细胞生命过程中执行各种不同的功能，对维持机体稳态具有重要作用。当细胞内蛋白成分或其表达水平发生改变时可导致疾病的发生。而疾病蛋白质组学的主要研究任务是利用蛋白质组学技术大规模筛选疾病发生过程中的标志性蛋白或新的药物靶标蛋白，这些蛋白可作为疾病诊断、鉴别及判断预后的潜在标记物或治疗靶点。目前蛋白质组学研究技术一般包括以下部分：样本提取与纯化、蛋白质分离和鉴定及数据处理与分析。而实验结果的准确可靠在很大程度上依赖于样品的质量。无论采取何种蛋白质分离或鉴定手段，样品制备都是最关键的步骤。目前疾病蛋白质组学研究面临的主要困难有生物学样品的复杂性、蛋白表达丰度不均衡等，需要在样品制备过程中采取一定措施去除高丰度蛋白的影响和降低样品成分的复杂性[2]。另外，相对于基因组而言，不同种类的细胞所包含的蛋白成分也不一致。组织、细胞株、原代培养细胞和体液如血浆或脑脊液等均可作为疾病蛋白质组学研究的样品来源，因此需要结合实验目的来选择合适的研究材料和制备方法。

1.1.1血液血液是临床上容易获得也是应用最广

泛的检测标本。血液中包含了机体内几乎所有的蛋白成分，许多研究表明血液中含有的小分子量蛋白/多肽，如激素肽或小分子分泌蛋白等，与疾病的发生密切相关，是疾病诊断、判断预后的潜在分子标记物和治疗靶点[3，4]。血浆是血液的液体组成部分，约占血液总量的55%。血液凝固后得到的液体成分即为血清。血清与血浆所含的蛋白成分基本相似，不同的是血清中不包含凝血因子。在大多数血生化实验中血浆和血清可以相互替代使用。但是由于获取血浆需要在血液样品中加入抗凝剂，有时会干扰实验结果，因此血清更适合用于一些特殊实验。目前大多数蛋白质组学研究采用的是血清标本，但是一些学者研究发现血浆和血清的蛋白图谱存在很大的差异[5，6]。目前仍没有足够的证据来支持蛋白质组学研究中应该选择血浆或是血清作为研究材料[7]。当然最理想的方法是将两者均应用于蛋白质组学研究，但这可能会使实验数据分析变得复杂。目前血清蛋白质组学研究面临最大的困难就是血清中蛋白含量的不均衡性。血清白蛋白和免疫球蛋白几乎占到血液中蛋白总量的90%，并且掩盖了一些重要的低丰度蛋白的表达信息[8]。离心超滤是一种能够去除血浆/血清中高分子量蛋白的简便方法，其原理是根据超滤膜孔径大小的不同，在离心作用下有选择性地滤除一些高分子量蛋白，从而达到富集低丰度蛋白的目的。该方法在肺癌、卵巢癌、肝癌等多种肿瘤蛋白质组学研究中得到广泛应用[9~11]。研究认为低速离心、样品稀释和变性是离心超滤成功的关键因素。另一种常用的方法是固相提取，即以固相为介质分离某种或某类蛋白的技术体系，包括离子交换柱、亲和层析柱、金属螯合柱以及不同形式的色谱柱等[12，13]。Jiang等

[14]

1选择合适的研究材料1.1人体来源的标本

作者单位：330006南昌，江西省人民医院病理科

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采用TCA、丙酮、三氯丁醇/甲醇、硫酸铵蛋白沉淀

[16]王锐.灭螺药物研究的历史及现状.中国血吸虫病防治杂志，2003，15（6）：478

（收稿日期2008-12-04）

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法及超滤法对去除人血浆中高丰度蛋白的效果进行了比较，认为硫酸铵蛋白沉淀法对去除血浆白蛋白更为有效。目前也可选择商品化试剂盒去除血浆中含有的多种高丰度蛋白[15]，但价格较为昂贵，而且许多低丰度蛋白分子仍有可能与高丰度蛋白非特异性结合而被一起去除。

杂等缺点。在组织取材时应尽可能减少组织异质性

[21]

。例如肿瘤组织的获取应尽可能去除间质、血液、

坏死组织等。新鲜组织应尽可能去除结缔组织和脂肪，在取材前用冰生理盐水冲洗干净，而且取材的器械也应保持清洁，最好用预先准备的含蛋白酶抑制剂的缓冲液冲洗，取材后应及时将标本冻存于液氮或-80℃中。近几年出现的激光捕获显微切割(LCM)技术在一定程度上解决了传统方法得到的样本均一性差的问题。LCM技术能高效地从复杂组织中特异性挑选出某一特定的同类细胞乃至单个细胞，但不会破坏组织结构，该技术极大降低了样品复杂性，因而特别适用于肿瘤学方面的研究。LCM虽然在很大程度上提高了待检组织的特异性，但是由于只能获取很少量组织标本的局限性，其蛋白检测的敏感性仍有待加强[22]。

1.1.2体液体液中所含的蛋白成分是反映活体功

能生物学信息的重要来源。例如脑脊液直接与神经组织接触，可以在一定程度上反映中枢神经系统的代谢变化。体液标本在临床中相对容易获得，病理状态下体液中一些关键蛋白分子发生了异常变化，可作为疾病诊断、治疗和判断预后的潜在指标[16]。因此体液可作为疾病蛋白质组学研究的重要研究材料。但是目前体液蛋白质组学所面临的最大挑战就是体液中所含的蛋白成分波动较大，实验结果重复性差。脑脊液是临床常见的体液标本，主要由脑室脉络丛分泌产生，成人每天可生成脑脊液约500~600ml。脑脊液对于神经中枢微环境有着相当重要的作用，通过对生理和病理状态下脑脊液蛋白图谱的差异比较，可以帮助我们寻找到脑损伤、神经系统退行性病变等疾病的新的分子标记物[17，18]。另外，脑脊液所含的蛋白成分与血浆相似，通过对其蛋白成分变化的检测，有利于帮助我们了解神经系统疾病发生发展的过程。但是脑脊液中盐离子较高浓度，而蛋白浓度相对较低[19]，因此需要采取一定的制备方法除盐和提高蛋白浓度。Chen[20]等比较了四种提取羊脑脊液中蛋白质的方法，发现采用商品化试剂盒及丙酮蛋白沉淀法可以获得较高浓度的蛋白样品。

另外，来自病灶引流区的淋巴液、尿液、支气管液、乳腺导管灌洗液和胸腹水等体液中含有病灶组织分泌、脱落或漏出而沉积在局部的蛋白质/多肽，是较好的生物学标志物研究材料，可作为疾病蛋白质组学研究的标本来源之一。

1.2细胞和动物模型目前关于人体材料的研究仍

存在颇多困难，主要原因是因为从人体获得组织标本受到很多，而且利用人体进行研究也存在着伦理道德问题。另外，一些疾病特异标志蛋白的低表达以及疾病个体化差异也对疾病蛋白质组学研究提出了新的挑战。人类疾病动物模型对于了解疾病的发生以及寻找有效的治疗方法具有十分重要的作用。啮齿类动物如大小鼠的生命周期较短，有利于我们研究疾病发生发展的整个过程。而且啮齿类动物与人之间的细胞内蛋白组分相似程度很高，因此可以利用这些动物模型在蛋白质组水平研究人体疾病的发病机理。当然，动物模型只是反映了疾病发生机制的某一方面，并不能代表疾病的所有特征。近年来发展的转基因动物也是研究疾病蛋白质组学非常有用的模型[23]。动物模型优点有：（1）取材方便；（2）可由同一个体取得病灶和非病灶组织，减少生物学“噪声”干扰；（3）可严格控制环境等因素，减少实验误差。然而建立动物模型也存在实验时间长、操作较复杂等缺点。而且研究中也要充分考虑到动物品种、性别、体重、饮食喂养等影响因素[24]。

与动物模型相比，细胞模型最大的优势就是样品的单一性以及实验条件的可控性，这在体内实验中是无法做到的。另外，细胞模型在样品制备时容易操作，不含有高丰度蛋白干扰（与体液样品相比），可以帮助我们检测一些在组织中未能检测到的低丰度蛋白，而且实验误差较小，实验结果准确可靠。其缺点是细胞不能长期培养下去，培养细胞的某些性状可发生改变，与体内细胞不一致而不能真实反映体

1.1.3人体组织人体组织来源可利用尸体解剖获

取一些标本，值得注意的是除了伦理道德因素外，在利用这些标本进行研究时应充分考虑年龄、性别、种族、病史以及死后到尸体解剖的间隔时间等影响因素。另外手术后切除的标本或活检组织标本也是人体研究材料的来源之一，这类标本可以反映活体组织的生物学信息。

相对于血液而言，从人体来源的组织标本特别是肿瘤组织具有蛋白含量高、高丰度蛋白干扰少等优势，但是也存在如组织细胞异质性大、样品成分复

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内环境，因此实验结果往往需要通过体内实验来进一步证实。另外细胞培养要求无菌，操作条件相对较高，因而在进行蛋白质组学研究时应充分考虑多方面因素后进行选择。上述生物学材料应用起来各有优缺点,关键是要结合自身的实际情况和研究目的来决定。

最好是在去除培养液后直接在培养瓶中加入适量的裂解缓冲液，孵育适当时间之后收集细胞进行超声匀浆，在通过离心获取上清-80℃冻存。组织破碎常用一些较为剧烈的方法如超声匀浆、机械匀浆、研磨法等。不同的组织具有不同的特性，如脑组织中含有丰富的脂质，应根据其特性来选择破碎方法。如果组织中含有较多的结缔组织成分，可以先将组织置于液氮中冷冻，再取出研磨成粉末，最后加入组织裂解液。组织研磨匀浆时应将组织完全磨碎直至看不见组织碎块为止。为了在操作过程中尽量减少热量产生，操作时应注意在冰上进行。由于破碎过程中细胞会释放一些蛋白水解酶，因此可以在组织细胞裂解液中适当加入一些蛋白酶抑制剂。另外应尽量使用新鲜的样品和裂解液，样品处理后最好分装置于-

2采取正确的样品制备方法

从蛋白质组大规模研究的角度而言，要求样品制备尽可能获得所有的蛋白质。但是由于蛋白质种类繁多、丰度不一以及物理化学性质多样等，要达到获得所有蛋白质的要求是有困难的。特别是在疾病蛋白质组学研究中样品制备尤其艰巨，因为样品多来源于组织和细胞，这些样品成分复杂，样品制备的关键是将被“掩盖”的重要蛋白成分暴露出来，一般都是低丰度蛋白和膜蛋白[25]。因此一方面要根据实验目的及蛋白质分离鉴定方法选择合适的制备方法，另一方面根据样品来源不同而采取不同的蛋白质提取方法。一般来说样品的制备应遵循以下几个基本原则：

80℃冰箱中保存，避免样品反复冻融。

2.3提高样品蛋白溶解性影响蛋白质溶解性的最

主要因素是溶液的pH值和盐浓度。提取液的pH值应选择在偏离蛋白质等电点两侧的pH范围内，防止过酸或过碱而引起蛋白质构像的不可逆变化。一般来说，碱性蛋白质适用于偏酸性的提取液，而酸性蛋白质适用于偏碱性的提取液。一些和脂质结合比较牢固的蛋白质可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂溶解。

由于蛋白质种类繁多，不同蛋白质由于结构和性质的差异，其溶解度也各不相同，可根据蛋白质的溶解特性选择不同的溶剂。尿素是最常用的离液剂，其主要作用是破坏氢键等蛋白次级键结构，从而使蛋白质发生变性。硫脲能够很好地破坏蛋白疏水性，一般2mmol/L硫脲与5~8mmol/L尿素结合使用，可以增加疏水性膜蛋白的溶解性。去污剂也可破坏蛋白质分子间的疏水作用，包括离子型、非离子型和两性离子型。目前常用的离子型去污剂有SDS，非离子型去污剂有TritonX-100和NP-40，两性离子型去污剂有CHAPS、ASB-14等。去污剂必须选择合适的浓度，浓度太低不能改善蛋白质的溶解性，而浓度太高会使蛋白点变宽，从而影响蛋白分辨率和引起横纹现象。还原剂能破坏蛋白分子间和分子内的二硫键，使蛋白完全解折叠。一般使用的还原剂有β-巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)和二硫赤藓糖醇(DTE)等。近年来人们在经典的尿素、去污剂加还原剂体系的基础上对样品裂解液组成进行了极大的改进，引入了一些新的离液剂（丁基脲）、去污剂（SB3210）和还原剂（DTE），极大提高了样品蛋白的溶解性。

2.1根据实验目的和样品来源选择制备方法在制

备样品时首先要明确实验目的是为了分离尽可能多的蛋白还是仅仅分离样品中某些感兴趣的蛋白，是需要让蛋白变性后进行双向电泳还是需要保持蛋白质的活性。这些目的直接决定了制备方法的选择。双向电泳是目前蛋白质组学研究中公认的经典方法，其样品要求必须具有较高的蛋白浓度（大于10mg/ml），而且应尽量避免一些干扰因素的存在，包括离子去污剂、盐类、核酸、多糖、脂类等。因此去除非蛋白杂质是双向电泳样品制备中的关键。随着蛋白质组学研究的日益深入，基于二维凝胶电泳的蛋白质分离技术面临的问题日益突出，例如对执行重要生理功能的低丰度蛋白、极酸或极碱蛋白、高分子量蛋白及膜蛋白的有效提取和分离存在困难等[26]。因此对双向电泳样品制备的条件应不断优化。另外，对于不同来源的样品（包括细胞、组织、体液等）应根据样品的性质、特点分别选择不同的提取方法。

2.2防止样品蛋白降解样品制备的第一步是细胞

或组织破碎。该步骤如果操作不当，就有可能导致蛋白的丢失。细胞或组织破碎的方法有多种，包括机械法、化学法和物理法三大类。这些方法有不同的应用范围，但基本原则是尽可能减少蛋白质的降解。如果是较易破碎的细胞，可以选择较为温和的渗透法或冻融法以达到裂解细胞的目的。在收集细胞样品时，

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2.4去除非蛋白杂质样品缓冲液中的盐离子浓度

过高将会影响到蛋白质分离、酶切、质谱鉴定等步骤，因此必须在样品中尽量去除。通常在体液标本如血浆、脑脊液、尿液中含盐较多。除盐方法有很多种，一般包括透析、超滤、凝胶过滤、TCA或有机溶剂沉淀以及固相提取等方法，当然也有商品化除盐试剂盒可供选择。Yuana和Desiderio比较了不同除盐方法的效果，认为与透析法相比，超滤法在除盐过程

[27]

对于实验材料的需求及样品制备技术也提出了更高的要求，因此还有待我们进一步地探索和提高。

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中容易丢失一些小分子蛋白，主要原因是由于这些蛋白易与超滤膜吸附所致。另外他们发现层析柱除盐可以获得最高的蛋白回收率。

除盐类外，样品中其它一些干扰因素如脂类、核酸、多糖等也必须去除，否则同样会影响到实验结果。例如多糖和核酸易与蛋白形成复合物，增加样品粘度，对蛋白等电聚焦有干扰，从而导致双向电泳图中出现横纹。去除多糖的常用方法有超速离心及

TCA/丙酮沉淀法，而去除核酸可以在样品中加入一些DNA或RNA酶对其进行消化降解。

2.5特殊样品的制备尽管各种高灵敏度的检测器

相继问世，但分析低丰度蛋白在疾病蛋白质组学研究中仍是一项挑战。虽然增加上样量和提高总蛋白溶解度能在一定程度上增加低丰度蛋白量，但由于同时也增加了高丰度蛋白含量，可造成蛋白叠加效应从而影响蛋白质分离效果。目前可采用样品预分级的方法来富集低丰度蛋白，即将总蛋白分成多个亚蛋白质组，再用窄范围的IPG胶条进一步分离蛋白。膜蛋白提取一直是蛋白质组学研究中的难点。首先与膜蛋白自身疏水性有关，它们主要溶于脂质双层而不溶于水，脂质的数量和性质会干扰膜蛋白在等电聚焦样品缓冲液中的溶解。分离纯化膜蛋白可选择适当的增溶表面活性剂，一般常用的有胆酸盐、

CHAPS、Emulgen和Lubrol等。另外，差速离心或密

度梯度离心法也是目前收集膜蛋白的常用方法，但该方法提取的蛋白纯度不高。近年来研究者们利用逐级抽提的方法较好地解决了膜蛋白提取及分离的问题。该方法根据不同组分蛋白溶解度的差异，采用具有不同溶解能力的溶解液进行顺序提取，从而提高了膜蛋白的可溶性[28]。

蛋白质组学是后基因组时代的重要研究内容，而采用蛋白质组学技术大规模筛选疾病特异性的潜在分子标记物和药物靶点也是相当有意义的工作。但是作为一门新兴学科，蛋白质组学在技术上仍然存在一些局限性，目前还不能完全满足大规模分离蛋白质的要求。另外，由于蛋白质分离和鉴定技术的不断发展，如LC-MS/MS、蛋白芯片等技术的应用，

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53

江西医药2009年3月第44卷第3期JiangxiMedicalJournal,Mar2009,Vol.44,No.3

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（收稿日期2008-11-12）

纵隔炎性假瘤行上腔静脉置换1例报道

徐全陈艰柳阳春张平龚南平胡建明谢爱民涂寒剑杨文凯林庆

[关键词]上腔静脉综合征；炎性假瘤；上腔静脉置换；纵隔[中图分类号]R3.6

1资料与方法

1.1临床资料病人男，41岁，主诉右颈部及右上肢水肿伴疼痛1个月。查体：右颈部及右上肢肿胀，右腋下及右胸壁有下行性浅静脉怒张。胸部CT示右肺尖纵隔旁结节2.3×2.9×2.5cm，分叶状。压迫上

腔静脉（附图）。

病理纵隔炎性假瘤。术前因上腔静脉综合征所致的右颈部及右上肢水肿于术后24～48h缓解，消退。

2讨论

上腔静脉综合征(SVCS)是一组由于通过上腔静脉回流到右心房的血液部分或完全受阻，并由此而产生的一系列症状。上腔静脉位于纵隔内，是一条粗而短的静脉干，长6～8cm，由左右头臂干汇合而成，收纳来自头、颈、上肢、胸壁的静脉血。上腔静脉周围被右主支气管、肺动脉、主动脉头臂动脉、胸腺及许多淋巴结所包围，由于其管壁较薄，内部血流压力低，很容易受到邻近组织占位性病变的影响或血栓形成而产生上腔静脉综合征。上腔静脉综合征通常继发于上纵隔的肿瘤或炎症,80%由恶性肿瘤引起,最常见的是支气管肺癌(占52%～81%)及淋巴瘤(占2%～20%)，乳腺癌、生殖细胞肿瘤、消化道肿瘤如食管癌、恶性胸腺瘤等也可引起SVCS。良性疾病如梅毒、结核、特发性纤维性纵隔炎、血栓性静脉炎、充血性心衰、主动脉弓动脉瘤等也可引起。纵隔炎性假瘤十分少见,国内外文献未见报道；由其导致上腔静脉综合征更罕见。外科治疗主要用于良性病因切除及改善造成的上腔静脉压迫。

（收稿日期2009-01-12）

附图上腔静脉压迫

1.2手术方法手术在全麻气管插管下进行。术中

监测中心静脉压，正中胸骨劈开入路。完整切除肿瘤及受累的上腔静脉、受侵的右肺上叶行楔形切除。并行上腔静脉置换，植入佰仁思人造血管直径为

1.5cm。先吻合右心耳,后吻合上腔静脉远心端。吻合

全部采用无创伤滑线连续外翻缝合。上腔静脉置换患者术后即持续抗凝并逐渐过渡到口服华法令将凝血酶原时间延长到正常临界值的1.2～1.5倍。术后

作者单位：330006南昌，江西省人民医院