免疫比浊法检测免疫球蛋白

免疫⽐浊法检测免疫球蛋⽩⼀、实验⽬的

利⽤免疫⽐浊法绘制标准曲线，并检测样品中免疫球蛋⽩的浓度。（本⼩组检测的为IgG样品）⼆、实验原理

1.抗原抗体反应(Antigen-antibody reaction)：抗原与其刺激机体产⽣的相应抗体在体内或体外发⽣特异性结合的反应。反应特点有：特异性、⽐例性、可逆性、敏感性。影响因素有：电解质、温度、酸碱度。

2.免疫⽐浊法：合适⽐例的抗原抗体形成的免疫复合物，在PEG作⽤下形成微粒，使样品浊度发⽣变化。当⼀束光线通过溶液受到光散射和光吸收两个因素的影响⽽使光的强度减弱，根据光的强度改变可测得微粒浓度。

分类：①透射⽐浊法（Transmission tubidimetry）当⼀定波长光线通过浊度发⽣变化的反应混合物时，由于被不溶性免疫复合物吸收⽽减弱，故在⼀定范围内吸光度与免疫复合物量呈正相关。当抗体浓度固定（过量），样品的浊度与其中所含抗原量成正⽐。（特点）透射⽐浊操作简便，适⽤于普通的⾃动⽣化分析仪和普通的分光光度计，⼏乎所有的实验室均能开展。不⾜的是灵敏度和精密度均不够理想，所需的抗⾎清量⼤，检测的时间较长。②散射⽐浊法（Nephelometry）光线通过检测溶液时，被其中所含的抗原抗体复合物折射⽽部分偏转，产⽣散射光，其强度与复合物的数量和散射夹⾓成正⽐，与光的波长成反⽐。（特点）优点是灵敏度、精密度均较⾼，检测快速。其缺点是需特定的分析仪器，试剂价格⾼。本实验采⽤透射法。

3.聚⼄⼆醇PEG的作⽤：在免疫反应中，为增强抗原抗体反应常使⽤增聚剂，3~4％的聚⼄⼆醇，可破坏抗原抗体的⽔化层，促进抗原抗体靠近反应，但如浓度不适合，会影响其它溶质或产⽣⾮特异性聚集影响结果。三、实验材料

免疫球蛋⽩A,G(IgA,IgG)测定试剂(试剂1[PEG]，试剂2[⽺抗⼈IgA, IgG]）（1管/每组）免疫球蛋⽩A, G(IgA,IgG)校准品，蒸馏⽔，⾎清样本（1管）微量加样、ep管（1.5mL离⼼管）酶标仪、⽔浴箱四、实验步骤

1.在7个EP管中各加250µL IgG试剂1（PEG）。

2.7管分别加⼊蒸馏⽔、校准品原液、1：2校准品、1：4校准品、1：8校准品、1：16校准品、样本各2µL。3.混匀后37℃⽔浴5min。

4.7管各加⼊85µL IgG试剂2（⽺抗⼈IgG）。5.混匀后37℃⽔浴10min。

6.分别吸取200µL⾄96孔酶标板中，⽤酶标仪在700nm处读取OD值。五、实验结果与数据处理

2.标准曲线

3.样本浓度：y=0.604代⼊x=26.8g/L由此得稀释之前样本的浓度为79.945g/L误差：（79.945-34.8）/34.8*100％=129.73%误差分析：

①抗原抗体反应需要⼀定孵育时间和温度，⽽操作中由于加样的速度，⽆法严格控制各管的反应时间；本次制作标准液时量极⼩，很有可能出现未混匀、挂壁的情况；标准液吸取量⼩会导致移液的误差被放⼤。

②免疫⽐浊法的基本原理是基于抗原抗体结合，⽽这个结合反应有特殊性，只有在⼀定范围浓度中，两者⽐例合适时检测结果才准确，否则会产⽣带现象，已有⽂章表明，稀释前后检测结果偏差很⼤(朱爱萍, 郭书云, 赵锐. 免疫⽐浊法检测异常⾎清免疫球蛋⽩的⽅法学探讨[J]. 现代检验医学杂志, 1999(4):33-34.)，所以我认为此样本虽然是由原液稀释三倍所得，但在溶液中IgG抗体的浓度都相同的情况下，两管中抗原抗体⽐例相差很⼤，所以检测结果也有偏差是可以理解的。同时再结合散点图拟合出的标准曲线，可以发现，浓度较⾼的两管标准液距离拟合曲线的偏差是最⼤的，由此推断，1：1原液和1：2原液并不适合本次实验中所给的⽺抗⼈抗体浓度（未知）。所以，误差来源除了以上所说原因之外，还有本次实验提供的抗体浓度，并不适合原液中IgG浓度的检测，⽽稀释三倍后的样品属⽐较适合的范围。所以最⼤的误差来源是抗体浓度的选择，虽然抗体浓度是保证过量的，但是过量的程度相对每个管来说是不同的，1：1和1：2也许需要更⼤的浓度。六、思考

1.本实验采⽤的免疫⽐浊法适⽤于⼈体内哪⼏种Ig？

⼈体⾎清中含有五类免疫球蛋⽩，分别为IgG、IgA、IgM、IgD、IgE。其中前三种含量相对较⾼，⽽IgD和IgE含量极低，膜结合型IgD构成BCR，是Bcell成熟的标志，IgE在正常⼈⾎清中含量最少，与Ⅰ型超敏反应和寄⽣⾍感染有关。理论上此五种Ig均可以采⽤免疫⽐浊法检测含量，但临床上常只检测前三种含量较⾼、疾病相关性更强的Ig，在考虑寄⽣⾍感染和变态反应性疾病时还可以检测⾎清中IgE的含量。

2.检测⾎清等体液标本中某种抗原分⼦的⽅法？

原理同本实验，采⽤抗原抗体结合的原理，凝集反应、沉淀反应、中和反应，以及免疫荧光法和酶联免疫吸附试验等，在使⽤抗原抗体结合原理时，将抗体加⼊荧光可以直接检测荧光强度来定量检测抗原含量，⽽酶联免疫吸附试验还可采⽤双抗体法以级联放⼤更易检测。

3.使⽤免疫⽐浊法时，抗原抗体的⽐例应采⽤哪个区域？

应采⽤抗体过量的前带，因为所检测的物质是抗原，希望所加样品中的抗原完全与抗体结合形成微粒，所有的微粒均可吸收酶标仪中透过的光线。因为吸光度OD值与溶液中颗粒的浓度成正⽐，⽽计算时默认颗粒的浓度与样品中所含抗原的浓度相当，所以，只有在抗体含量过量时，才能保证所有抗原都能与抗体结合形成微粒，降低因抗原未完全结合抗体所带来的误差。⽽且结合本次误差，不同管抗体过量的程度也应该⼤致相当。4.为何波长选择700nm？

抗原抗体结合后的吸光度受抗原抗体种类的影响，本次采⽤的是⽺抗⼈Ig抗体，应该由经验值可知700nm是IgG抗原抗体结合后最⼤的吸收波长，在最⼤吸收波长处通过测吸光度来测浓度所得结果的误差最⼩。