24生物化学实验--重组质粒的构建.doc

【目的】

1. 验证基因工程的基本理论和聚合酶联链反应的基本原理。

2. 熟悉重组质粒的构建和利用聚合酶联链反应法获取目的基因的方法。 3. 了解PCR仪的使用方法。

【原理】

1. DNA的分离与纯化原理

基因组DNA因来源不同、性质不同以及用途不同，苏分离纯化的方法也不相冋。 哺乳动物细胞基因组DNA的分离与纯化的方法主要有酚抽提法、甲酰胺解聚法、 玻棒缠绕法以及各种快速方案。本实验以哺乳动物细胞为例，介绍制备高分子量 DNA样品的酚抽提法。酚抽提法可用于多种来源标本的高分子量DNA样品的制 备，伍括单层培养细胞、悬浮生长细胞、新鲜的组织以及血液标木等。

本实验所用的酚抽提法源自对1976年Stafford及其同事提出的方案的改进。 它以含EDTA、SDS及RNA酶（无DNA酶）的裂解缓冲液裂解细胞，经蛋白 酶K处理后，用pH8.0的Tris饱和酚进行抽提，离心分层后，蛋白质因变性 位于有机相与水相的界面，而DNA进入水和，重复抽提DNA至一定纯度，根据 不同需要进行透析或沉淀处理，获得所需范围的高分子量DNA样品。

分离过程中RDTA为二价金属离子螯合剂，可以抑制DNA酶的活性，同时降低 细胞膜的稳定性。SDS为生物阴离子去垢剂，主要引起细胞膜的降解并能乳化 脂质和蛋白质，SDS与这些脂质和蛋白质的结合可以使它们沉淀，SDS的非极 性端与膜磷脂结合，极性端使蛋白质变性和降解，所以SDS同时还有降解DNA 酶的作用。无DNA酶的RNA酶可以有效水解RNA ,而避免DNA的消化。蛋白 酶K则冇水解蛋白质的作用，可以消化DNA酶和DNA上的蛋白质，也冇裂解 细胞的作用。酚可以使蛋白质变性沉淀，也可抑制DNA酶的活性。pll8.0的 Tris缓冲液能保证抽提后DNA进入水相，而避免滞留于蛋白质层。多次抽提, 可提高DNA的纯度。一般在第三次抽提后，吸出含DNA的水相，做透析或沉淀 处理。透析处理能减少对DNA的剪切效应，因此可以得到200kb的高分子量 DNA。沉淀处理常以乙酸铵为沉淀用盐，用无水乙醇沉淀，并用70%的乙醇洗 涤，最后得到的DNA大小为lOOkb〜150kb。

2. 聚合酶链反应的原理

聚合酶链反应（polymerase chain reaction , PCR ）类似于天然的复制过程， 用于体外扩增位于两段已知序列之间的DNA区段（靶序列），其原理是通过Taq DNA聚合酶催化的DNA合成反应达到对靶序列的扩增。反应中使用两段化学合

成的寡核苷酸作为引物，分别与模板DNA两条链互补，待扩增片段的序列位于 两条引物之间。PCR扩增色括3个步骤，即变性、退火和延伸。首先对反应 混合液进行95°C加热以使模板DNA双链变性，成为两条单链。随后，将反应 混合液冷却至引物的熔解温度(Tm)以下，一般比Tm低5°C，使引物能与靶 序列发生退火，形成引物与模板的杂交双链。当温度升至72°C左右，反应体系 中的TaqDNA聚合酶便按照模板链的序列以碱基互补方式依次把dNTP加至引 物的3 '端，使互补链以5 ->3 方向不断延伸，直至形成新的DNA双链。

通过变性、退火和延伸的一个循环可以使靶序列数量增加一倍。由于每次扩增的 产物又作为下一次扩增的模板，因此，反应产物量以指数形式增长，一个分子的 模板经过n个循环可得到2 n个分子拷贝产物。

本实验扩增的是分泌性磷脂酶A 2 (sPLA 2 )的基因序列，片段的长度为 238bp。扩

zz

增所用的上游引物序列为5 -AAG CCG CAC TCA GTT ATG G -3 ， 下游引物序列为:5 x

-TCA CAC TAT TCC GAC GAC G-3 '。 【器材】

1. 匀浆机、匀浆器或研磨器2.低温冷冻高速离心机3.恒温水浴箱

4. 紫外分光光度计5.可调式微量移液器、1.5ml离心管、微量加样吸头、离 心管、PCR管及三角烧瓶等6.PCR仪7.凝胶成像分析仪8.微波炉9.电泳 槽、电泳仪 10. 旋涡混匀器11.紫外检测仪12.碎冰

【试剂】

1. Tris-HCl 缓冲液(即 TBS 溶液)称取 8g NaCl、0. 2g KC1 及 3g Tris 碱溶于800ml蒸馏水中。加入0.015g的酚红，以HC1调节pH至7. 4，然 后加蒸溜水至1000ml。分装后，1.05kPa/cm 2高压蒸汽灭菌20min。

2. lmol / L Tris-HCl (pH8. 0)贮存液在 800ml 蒸馏水中溶解 121. lg Tris 碱，加入浓11C1调pll至8.0 (约加入浓11C1 42m 1,应在溶液冷却至室温后 方可最后调定pH值)，加水定容至1000ml，分装后高压灭菌。

3. 0.5 mol/L EDTA(pH8. 0)贮存液在800ml蒸馏水中加入186. lg二水乙二胺 四乙酸二钠(EDTA-Na2 • 2 H 2 0),在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用NaOH调pH 值至8.0 (约需20gNa0II颗粒)后定容至1000ml ,分装后高压灭菌备用。

4.20% (m/V)的SDS贮存液在900m 1蒸馏水屮溶解200g电泳级SDS ,加 热至68°C助溶，加入几滴浓HC1调节溶液的pH至7.2，加水定容至 1000ml，分装备用。 5 .裂解缓冲液含 10mmol/L 的 Tris-HCl ( pH 8. 0 )、0. 1 mol/L 的 EDTA(pH8.0)、0. 5%(w/v)的 SDS 以及 20 P g/ ml 的无 DNA 酶的胰 RNA 酶。

其中无DNA酶的胰RNA酶需临用时加入，其它溶液需预先分别配制成较高浓度 的贮备液并于室温保存。

6 .蛋白酶K(20mg/ml)以消毒的50mmol/L的Tris(pH8. 0)溶液配制，小量 分装，_20°C保存。

7. Tris 饱和酚(pH 8.0)以 0. 5mol/L 的 Tris-HCl (pH 8. 0)与 0. 1 mol/L 的 Tris-HCl(pH 8.0)进行充分的平衡。

8. 10mol/L的乙酸铵溶液称取77g乙酸铵，室温条件下溶于70m 1蒸馏水中， 补足蒸馏水至100m 1 ,用0.22um的滤器过滤消毒，4°C或室温密封保存。 注意乙酸铵不可用热水溶解与高压消毒。 9. 无水乙醇与70 %的乙醇

10. TE (pH 8.0)缓冲液含 10mmol/L 的 Tris-HCl (pH 8. 0 )和 1 mmol/L 的 EDTA ( pH 8. 0 )。

11. 液氮组织标本选用。

12. 酸性柠檬酸葡萄糖溶液B (即ACD溶液)血液标本选用。含0. 48%(m/V) 的柠檬酸、1.32 % (m/V)的柠檬酸钠和1.47 % (m/V)的葡萄糖。

13. 溴化乙锭(EB )用无菌水配成10mg/mL的贮存液，室温保存于不透光的 玻璃瓶中。DNA染色时的终浓度一般为0.5pg/ml。 14. 1.2 %琼脂糖

15. 对照 DNA ( P-actin )

16.5XTBE电泳缓冲贮备液称取gTris碱和27. 5g硼酸，溶于20ml 0.5mol/L的EDTA溶液(pH8. 0)。应用液为0.5XTBE ,将贮备液用消毒双蒸 水稀释10倍即可。 17. 模板DNA普通PCR反应体系中模板量一般为lOOng左右。

18. 引物扩增所用的上游引物序列为5 ' -AAG CCG CAC TCA GTT ATG G -3 ,， 下游引物序列为 3 ' -GCA GCA GCC TTA TCA CAC T -5 '。

19. dNTP混合液等体积混合dATP、dGTP、dCTP、dTTP使每种终浓度为

2. 5minol/L ,配制成dNTP混合液于-20°C保存。PCR反应体系中dNTP的终 浓度一般为0. 2mmol/L左右。浓度过高会影响反应的特异性，浓度过底会影响 PCR的扩増效率。

20. Taq DNA聚合酶50 u 1 PCR反应体积屮加人2. 0U Taq DNA聚合酶。酶过多 会增加反应的碱基错配率，降低反应的特异性。

21. 10XPCR反应缓冲液1OXPCR反应缓冲液中含有500imnol/L KC1 , 100mmol/L

Tris-HCl (pH8. 3) , 15mmol/L MgCl 2。50 u 1PCR 反应体系中加 5ul缓冲液，它的作用是保证反应体系的弱碱性和最适pH ,使Taq DNA聚合 酶正常发挥作用。

22. 凝胶加样缓冲液(6X加样缓冲液)溴酚蓝lOOmg ,加双蒸水5ml ,在 室温下过夜，待溶解后再称取蔗糖25g ,加双蒸水溶解后移入溴酚蓝溶液中， 摇匀后定容至50ml，加入NaOH 一滴，调成蓝色。 23. 质粒 pUCm-T ( 0.5ug/ul ) 24. T 4 DNA Ligase

25. 10 X T 4 DNA Ligase 缓冲液 26. 标准分子量的DNA ( Marker )

【操作】

l. DNA的分离与纯化 (1 )细胞的收集与裂解

在此分别介绍Y两种不同来源与类型标本的收集与处理法，可任选其一进行细胞 的收集与裂解。

①组织标本的收集与裂解：将清洁的新鲜组织剪成碎块，置于盛有液氮的研钵 (研钵需先用液氮预冷)中，将组织碎块研磨成粉末状。待液氮蒸发，将组织粉 末一点一点地加入盛有约10倍体积的裂解缓冲液的烧杯中，使组织粉末分散于 裂解缓冲液液面，然活振摇烧杯使组织粉末完全浸没于裂解缓冲液屮。将该溶液 转入50ml聚丙烯离心管中，37°C温育lh得到细胞裂解液后立即转入步骤 (2)。

②血液标木的收集与裂解：在无蘭条件下，收集血液标木，新鲜的血液标木均 可用于高分子量DNA的制备。对新鲜血液标本，以3.5ml的ACD或EDTA溶 液用于20m 1新鲜血的抗凝。将抗凝血转入离心管，4°C， 1300g低温离心 15min ,吸去上层血浆，用巴斯德吸管将含有白细胞的淡黄层悬浮液小心转入另 一新的离心管。重复离心一次，弃掉污染的血浆与红细胞。吸出淡黄层悬浮液， 重悬于15m 1裂解缓冲液中，37°C温育lh得到细胞裂解液后立即转入步骤 (2)。

(2 )蛋白酶K的消化

将上述细胞裂解液移入离心管中(液而高度应不超过离心管高度的1/3 )。加 入20mg/ml的蛋白酶K至终浓度为100ug/ml。用一玻棒温和地将酶液与粘

滞的细胞裂解液混匀。将该溶液罝50°C水浴3h，水浴期间不时旋动该粘滞溶 液。

(3 )酚的抽提

待上述溶液冷却至室温后，加入等体积O.lmol/L的Tris-HCl (pH8. 0)平衡的 酚。温和地来回颠倒离心管lOmin ,使两相混匀。若两相未能形成乳浊液，则 将离心管置于旋涡混匀器上混匀lh。然后5000g室温离心15min,使两相分 层。以大口径移液

管将粘滞的上层水和移入一洁净的离心管中。用酚重复抽提两 次，合并水相。

(4 ) DNA的沉淀

用于制备分子量为lOOkb〜150kb的DNA。在酚的三次抽提后，将全部水相 移入一洁浄离心管中。于室温下，加入0.2倍体积的10mol/L的乙酸铵和2倍 体积的无水乙醇，转动离心管直至溶液充分混匀，DNA立即形成沉淀，此时应 于室温下5000g离心5min，收集DNA沉淀◊以70%的乙醇洗涤DNA沉淀两 次，5000g离心5min ,收集DNA样品。尽量吸去70 %的乙醇溶液。在室温 下，打开离心管盖，待可见的残留乙醇挥发完(不可使DNA完全干燥，否则DNA 极难溶解)。按每0.1ml的起始细胞(5X10 7 /ml)加入1ml的TE (pH8. 0) 缓冲液，置离心管于摇床上，40°C轻轻旋动溶液12h〜24h，直至DNA完 全溶解。然后rc分装保存。

(5 ) DNA质量鉴定

DNA的质量鉴定包括浓度分析、纯度鉴定以及大小完整性的分析。浓度分析与纯 度鉴定最简便快速的方法是紫外分光光度法。通过A 260可以定量，通过A 260 /A 280的比值可以分析其纯度。1个A 260和当于50 u g的双链DNA, A 260 /A 280的比值为1.8是高纯度DNA的标志。但需要注意的是，由于高分子量 的DNA样品非常粘稠，匀质性不好，因此在常规鉴定吋所取的DNA样品并不能 很好地反映整个DNA制品的质量。

2. PCR基因扩增 (1 )配制PCR反应体系

取3支1.5ml离心管，分别标为样品管、阳性对照管和阴性对照管，按下表操 作：

PCR反应体系(u 1) 10XPCR反应缓冲液 样品管 5.0 4.0 4.0 4.0 23.0 阳性对照管 5.0 4.0 4.0 4.0 23.0 阴性对照管 5.0 4.0 4.0 4.0 25.0 — 2.0 上游引物 下游引物 dNTP混合液 ddH 2 0 sPLA 2 3 -actin Taq DNA聚合酶 8.0 70°C , 4min后取出冰浴 2.0 2.0 8.0 — 把装有上述试剂的试管在旋涡混匀器上作短暂混合，12000rpm离心15s ,使 液体沉至管底。

(2 )输入反应程序在作PCR扩增以前必须确定反应程序并且将反应程序输 入PCR仪。一个完整的PCR扩增程序主要包括循环前的变性、由变性-退火- 延伸组成的循

环反应和循环后的延伸等步骤。本实验的扩增程序为：94°C变性 5min后进人循环扩增，在94°C变性60s ,在°C退火45s , 72°C延伸 90s。重复30个循环后，于72°C再延仲lOmin。

(3 )扩增反应把PCK反应管放入PCR仪，按仪器操作要求启动扩增程序。 反应结束后，将PCR反应管于12000rpm，离心15s ,取扩增产物进行电泳分 析(也可将PCR产物置TC冰箱保存待鉴定)。 3. PCR产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定

(1) 1.2 %的琼脂糖凝胶板的制备①称取1.2g琼脂糖，加电泳缓冲液

(0. 5XTBE)100ml，微波炉加热溶解。待凝胶冷却至50〜60°C后(手感能耐 受)，加溴化乙锭5ul (终浓度0.5pg/ml )，混匀后迅速倒入己备好的制 胶器内，厚度为3〜5mm。室温放置10〜30min ,使其凝固。②小心取 出梳子，将凝胶板置于电泳槽屮，倒入0.5XTBE电泳缓冲液，使液面高于凝胶 1 〜2mm 。

(2 )加样分别取PCR扩增产物5ul ,各加lul凝胶加样缓冲液，混>J, 加入点样孔中。

(3 )电泳接通电源线，开启电源开关，调电压为10v/cm电泳至指示剂移入 凝胶后，再以5v/cm继续电泳至溴酚蓝移距凝胶前沿约Ion处，停止电泳，一 般需30min。若要制备较好的电泳图谱，采用小电压、长时间电泳(甚至过夜)， 可取得较好分辨率和整齐的带型。

(4 )观察分析结果将电泳后的凝胶板放在紫外灯下观察，可见桔红色荧光 DNA条带，根据条带的位置和数0分析PCR扩增结果或置凝胶成像系统中观察、 拍

Z

照、分析结果。

4. PCR产物的纯化

用试剂盒纯化PCR产物，纯化后进行琼脂糖凝胶电泳(同步骤3 )，分析其 质和量。

5. 重组质粒的连接

将纯化后的PCR产物与质粒pUCm-T进行连接，按下表操作:

试剂(U 1 ) 10 X连接缓冲液 pUCm-T PCR产物 标准反应管 1 1 2 — 1 5 阳性对照管 1 1 — 2 1 5 背景对照管 1 1 一 — 1 7 对照DXA T4 DNA Ligase 蒸馏水 4°C ,连接 16h。

【注意事项】

1. DNA的分离与纯化

(1)对高分子量DNA的制备，由于剪切力的危害甚大，因此每一步都要特别 小心温和地操作，避免激烈的吸取、振荡与混匀。

(2 )酚的制备要特别小心。一方面，酚的腐蚀性很强，可引起严重的灼伤， 应在化学通风橱中进行操作，操作时须戴手套。与酚接触过的皮肤，应使用大量 的水清洗，并用肥皂水洗涤，忌用乙醇。另一方面，用于DNA制备的酚应重蒸 馏后，用 0.5mol /L 的 Tris-HCl (pH8. 0)平衡一次，并用 0. lmol/L 的 Tris-IICl(pII8. 0)进行多次充分的平衡，直至有机酚相的pll值在7.8〜8.0 之间。用于制备DNA的酚，其pH值必须接近8.0，否则在酚的抽提过程中DNA 会因为变性而进入两和界面的蛋白质层，低于7.0时则进入有机酚相。制备好 的酚溶液可转入不透光的玻璃瓶中，在其上面覆盖一层0.01 mol/L的 Tris-IICl(pII8. 0)缓冲液，于rC可保存一个月。 (3 ) A 260 /A 280的比值为1.8是高纯度DNA的标志，高于或低于此值 均表示不纯。但比值为1.8的DNA溶液也不能完全断定为纯的DNA溶液，可 能兼有蛋白质、酚与RNA的污染。其中蛋白质与酚的污染均使比值下降，而RNA 的污染则使比值升高。一般情况下A 260 /A 280的比值在1. 75〜1.80之间 是可以接受的。但A 260 /A 280的比值若低于1.75 ,则表明冇显著量的蛋白 质污染，此时需要加入终浓度为0. 5 %的SDS，并重复步骤2〜4。

(4 )进行组织标本的高分子量DNA提取时，最好是新鲜的标本。由于组织标 本含

有大量的纤维结缔组织，耍得到产量较高的高分子量DNA比较困难，需耍 首先清除血液及筋膜等纤维结缔组织，并将组织搅切或研磨成粉末状。

(5 )操作期间禁止交谈防止唾液屮的RNA酶消化RNA。 2. PCR基因扩增

由于PCR只有超敏感性的特点，极微量的污染便可导致假阳性结果。污染可能 来自样品污染、扩增试剂、仪器污染和扩增产物交叉污染等。因此必须采取相应 预防措施避免发生污染。

(1)工作区隔离分样品处理区和PCR扩增分析区。

(2 )试剂取样及分装耍用绝对安全无污染的器皿；大包装的试剂用前应分成 小包装。

(3 )操作中防污染操作时要戴手套，如有污染要及时更换；装有试剂的离心 管每次开盖前要离心片刻，开盖要小心，防止液体溅出；吸每种试剂均要换头; 临床检验屮样品移液器与吸DNA模板的移液器要分开使用，并且每次PCR均同 时设阳性对照、阴性对照和弱阳性对照。

(4 )污染处理①稀酸处理法：常用稀酸处理含有扩增产物的离心管和电泳 槽及电

泳托盘等；②紫外线照射PCR工作室，特别是电泳槽、电泳托盘、离 心机、冰盒和移液器等。 【思考题】

1. 试述利用酚提取法提取及纯化DNA的原理。

2. A 260 /A 280的比值为1. 8是DNA高纯度的标志。现在有一个DNA样品A 260 /A 280的比值为1.8能否完全断定为纯的DNA溶液，为什么？ 3. 试述重组质粒构建的原理。