A型猪流感病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

欧阳振宇;唐连飞;朱中武;肖家勇;孟芳;黄萍;吴愈柏

【摘 要】根据WHO摊荐的检测A型猪流感病毒的引物和探针序列,建立了A型猪流感病毒实时荧光定量PCR检测方法.使用含有选定检测序列的重组质粒标准品绘制标准曲线,检测结果表明,该方法的敏感性可达100拷贝/25μL反应体系,显示出良好的敏感性和重复性,临床上已用于实验室鼻拭子样品的检测,并成为一种快速定量检测A型猪流感病毒的方法. 【期刊名称】《中国畜牧兽医》 【年(卷),期】2010(037)009 【总页数】3页(P75-77)

【关键词】A型猪流感病毒;实时荧光定量PCR;H1N1亚型 【作 者】欧阳振宇;唐连飞;朱中武;肖家勇;孟芳;黄萍;吴愈柏

【作者单位】湖南出入境检验检疫局检验检疫技术中心,长沙,410004;湖南出入境检验检疫局检验检疫技术中心,长沙,410004;湖南出入境检验检疫局检验检疫技术中心,长沙,410004;湖南出入境检验检疫局检验检疫技术中心,长沙,410004;湖南出入境检验检疫局检验检疫技术中心,长沙,410004;湖南出入境检验检疫局检验检疫技术中心,长沙,410004;湖南出入境检验检疫局动物检疫处,长沙,410004 【正文语种】中 文 【中图分类】S852.65+9.5

流行性感冒简称流感,是由甲(A)、乙(B)、丙(C)三型流感病毒引起的急性呼吸道传染病。A型流感病毒的亚型由血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)2种主要表面蛋白决定,根据其血凝素和神经氨酸酶基因的不同可分为16个HA亚型(H1～H16)和9个 NA亚型(N1～N9)(李广波等,2010)。2009年3月,墨西哥等国暴发较大规模的流感,其病原为新型甲型H1N1流感病毒株,病毒基因中包含有猪流感、禽流感和人流感3种流感病毒的基因片段(范锋等,2008)。笔者根据WHO(2009)推荐的检测A型猪流感病毒的引物和探针序列,建立了A型猪流感病毒实时荧光定量PCR检测方法,并对2445份临床猪鼻棉拭子样品进行了检测。 1 材料与方法

1.1 毒株与核酸样品 H1N1亚型猪流感病毒毒株及猪鼻棉拭子样品均由湖南出入境检验检疫局技术中心动植物检疫实验室保存。

1.2 主要试剂与仪器 RNA提取试剂盒为QIAGEN公司产品;AgPath-ID one-step RT-PCR Kit购自ABI公司;pGEM-T Easy载体、T4 DNA连接酶、T4 DNA连接酶2×快速连接缓冲液、JM109感受态细胞均购自 Promga公司;质粒提取试剂盒(TIANpure Mini Plasmid Kit)购自TIAN-GEN公司;胶纯化试剂盒(TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit)购自宝生物工程(大连)有限公司;Roche Light Cycler 480荧光定量PCR仪。

1.3 引物和探针的设计与合成 引物和探针由宝生物工程(大连)有限公司合成,其中探针5′端标记FAM报告基团,在中间“T”碱基上标记淬灭基团BHQ1,末端磷酸化,以免探针在Taq酶作用下延伸。 1.4 质粒标准阳性模板的制备

1.4.1 目的基因的扩增 以提取得到的H1N1亚型猪流感病毒的M基因为模板,利用上述特异性引物经PCR进行基因扩增。基因扩增反应总体系为20 μ L,含 2 ×Mix

缓 冲液 10 μ L,上 、下 游引 物各0.5 μ L(浓度均为 10 μ mol/L),逆转录酶 0.5 μ L,RNA 模板5 μ L,无核酸酶水3.5 μ L 。反应程序为:45℃逆转录30 min;95℃预变性3 min;95℃变性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s,共30个循环;72℃延伸7 min。反应结束后,取5 μ L PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳检测扩增结果。 1.4.2 重组质粒的构建、测序与浓度测定 基因的PCR产物经电泳、胶回收纯化后,与pGEM-T Easy载体连接,转化到JM109感受态细胞中,平板培养挑选转化长出的10个白斑菌落进行单克隆培养,并提取质粒进行PCR鉴定。对含目的基因的重组质粒进行测序,并与H1N1亚型猪流感病毒M基因序列进行比较。

通过微量分光光度计测定质粒浓度,并根据公式计算每微升液体中质粒的拷贝数。 1.5 标准曲线的绘制 提取得到的质粒经微量分光光度计测定,其浓度为32.1 ng/μ L,每个碱基的平均分子质量为660 u,重组质粒大小为3210 bp,经计算,重组质粒的 DNA分子质量为2118600 u,重组质粒的DNA分子数=6.02×1023=9.12×109拷贝/μ L 。

依次稀释成1010至100拷贝/25 μ L反应体系的浓度,用其作为A型猪流感病毒的标准品制作标准曲线,从而确定每25 μ L反应体系中的拷贝值。每个25 μ L反应体系中,2×PCR缓冲液12.5 μ L,25×RTPCR enzyme mix(含逆转录酶和 Taq 酶)1 μ L,上 、下游引物各 0.5 μ L,探针0.5 μ L,引物和探针浓度均为10 μ mol/L,增强剂 1.7 μ L,模板 3 μ L,无核酸酶水5.3 μ L,混匀后置于 Roche Light Cycler 480荧光定量PCR仪上进行扩增,反应条件为:95℃逆转录酶灭活/初始退火10 min;95℃退火15 s,55℃延伸30 s,共40个循环。对A型流感病毒RNA的定量可通过与标准品的循环阈值(Ct值)相比计算得出。

1.6 重复性试验 将浓度为106拷贝/25 μ L反应体系的重组质粒按照1.5中的方法重复8次,计算实时荧光定量PCR试验的变异系数(CV)。

1.7 敏感性试验 将提取得到的重组质粒无限稀释后实时荧光定量PCR试验,从而确

定敏感性。

1.8 临床样品检测 以重组质粒作为阳性对照,无核酸酶水作为阴性对照,对2445份临床猪鼻棉拭子样品进行定量检测。每个25 μ L反应体系中:2×PCR 缓冲液 12.5 μ L,25×RT-PCR enzyme mix 1 μ L,上 、下游引物各 0.5 μ L,探针 0.5 μ L,引物和探针浓度均为10 μ mol/L,增强剂 1.7 μ L,猪鼻棉拭子样品 RNA 8.3 μ L,混匀后置于 Roche Light Cycler 480荧光定量PCR仪上进行扩增,反应条件为:50℃逆转录30 min,95℃逆转录酶灭活/初始退火10 min;95℃退火15 s,55℃延伸30 s,共40个循环。 2 结果与分析

2.1 A型猪流感病毒基因的PCR扩增 PCR扩增结果显示,扩增出1条大小约200 bp的特异片段,与预期结果196 bp相吻合(图1)。

2.2 A型猪流感病毒基因重组质粒的构建、测序对重组质粒进行PCR鉴定,结果显示,10个重组质粒均扩增出大小约200 bp的特异片段,与预期结果196 bp相吻合(图2)。结果表明,目的基因已克隆入载体中。经宝生物工程(大连)有限公司测序,与H1N1亚型猪流感病毒的M基因碱基序列一致。

2.3 标准曲线的绘制 用不同稀释度的目的基因质粒标准品分别进行实时荧光定量PCR反应,进而计算得到标准曲线。从左到右的反应模板依次为109至102拷贝/25μ L反应体系,在该浓度范围内有良好的线性关系,阴性对照无扩增反应。以起始模板的对数值为x轴,Ct值为y轴做回归曲线,即得检测A型猪流感病毒的标准曲线(图3),斜率为-3.636,截距为40.44。从而可以得出拷贝数与Ct值之间的线性关系表达式为:Ct=-3.636×lg(拷贝数)+40.44,将待测样品的Ct值代入表达式即可计算出它的初始拷贝数。

图3 qPCR的标准曲线

2.4 重复性试验结果 重复性试验结果如图4所示,8次试验的 Ct值分别为 10.60、10.65、10.63、10.70、10.65、10.65、10.56、10., 平均值(¯X)=10.635,平均偏差(S)=0.038406,变异系数 (CV)=0.36%,表明该检测体系稳定,具有良好的重复性。 2.5 敏感性试验结果 试验结果表明,在25 μ L反应体系中,当含目的基因的质粒含量在109至102拷贝时,呈现良好的线性关系。含量大于102拷贝,即出现典型的扩增曲线,显示出良好的敏感性(图5)。

2.6 临床样品检测结果 经检测,2445份临床猪鼻棉拭子样品均为阴性。 3 讨论

猪流感是猪的一种急性、高度接触性呼吸道传染病,自美国1918年首次报道此病以来,世界各大洲均有本病的发生和流行,它能引起猪的高发病率(几乎100%)和低死亡率(病死率≤1%),对猪群危害极大。

目前,科研人员已从猪体内分离到 H1N1、H1N2、H1N7、H3N2、H2N3 、H3N1 等 11 种不同亚型的猪流感病毒(Lee等,2009;Ma等,2006)。而近几年研究结果表明,中国猪群中以H1N1和H3N2亚型流感病毒危害比较严重(陈艳等,2009;Newman等,2008)。

笔者通过 Roche Light Cycler 480荧光定量PCR仪,运用实时荧光定量PCR技术建立了一种快速检测A型猪流感病毒的方法,并通过计算核苷酸拷贝数,达到定量检测的目的。该方法重复性和敏感性都较好,不仅可以对包括H1N1亚型在内的A型猪流感病毒进行定性,而且可以定量检测,并在一定程度上弥补了传统检测方法在重复性和时间上的不足(张鹤晓等,2004),因此在临床上对A型猪流感病毒的大批量、快速诊断具有极大的实用价值。

参考文献

1 张鹤晓,赖平安,刘环,等.荧光RT-PCR检测活禽和禽组织中禽流感病毒的研究[J].检验检疫科学,2004,14(1):1～5.

2 李广波,潘欣.2009甲型 H1N1流感病毒新进展[J].医学研究生学报,2010,23(1):90～93.

3 陈艳,张春明,乔传玲,等.H3N2亚型猪流感病毒实时荧光定量PCR快速检测方法的建立[J].中国兽医科学,2009,39(10):4～9.

4 范锋,倪谷音,毛爱民,等.猪流感病毒 H1N1分离株 HA基因的克隆与序列分析[J].动物医学进展,2008,29(8):48～51.

5 谢金文,苗立中,沈志强.猪流感病毒蛋白研究进展[J].中国畜牧兽医,2009,36(11):157～161.

6 Lee J H,Pascua P N,Song M S,et al.Isolation and genetic characterization of H5N2 influenza viruses from pigs in Korea[J].J Virol,2009,83(9):4205～4215.

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8 Newman A P,Reisdorf E,Beinemann J,et al.Human case of swine influenza A(H1N1)triple reassortant virus infection,Wisconsin[J].Emerg Infect Dis,2008,14(9):1470～1472.