利用酵母单杂交方法筛选大豆根融合基因表达cDNA文库_刘清醒

第2期4月

大豆科学SOYBEANSCIENCEVol．32Apr．

No．22013

利用酵母单杂交方法筛选大豆根融合基因表达cDNA文库

1121

刘清醒，郭长虹，毕影东，郭东林

（1．哈尔滨师范大学生命科学与技术学院/黑龙江省分子细胞遗传与遗传育种重点实验室，黑龙江哈尔滨150025；2．黑龙江省农业科学院耕作栽培研究所，黑龙江哈尔滨150086）

摘要：酵母单杂交体系通过筛选cDNA文库可直接得到与靶序列相互作用的蛋白质基因序列，是研究DNA-蛋白质

相互作用和转录因子功能的最常用、最有效的方法之一。通过构建与Gal4p的激活结构域融合的表达cDNA文库，利box顺式元件采用酵母单杂交方法对该文库进行了筛选，共得到4个阳性克隆。结果用抗病相关基因启动子区的W-box相互作用的WRKY蛋白奠定了基础。为进一步研究与顺式元件W-关键词：大豆；cDNA文库；酵母单杂交

中图分类号：S565．1文献标识码：A9841（2013）02-0165-03文章编号：1000-

ConstructionofFusionGeneExpressioncDNALibraryofSoybeanRootwithYeastOne-hybridMethod

LIUQing-xing1，GUOChang-hong1，BIYing-dong2，GUODong-lin1

（1．KeyLaboratoryofMolecularCytogeneticsandGeneticBreedingofHeilongjiangProvince/CollegeofLifeScienceandTechnology，HarbinNormalUni-versity，Harbin150025，China；2．CropTillageandCultivationInstituteofHeilongjiangAcademyofAgriculturalSciences，Harbin150086，China）

Abstract：Genesequenceofproteinwhichinteractedwithspecificcis-elementcanbefoundbyscreeningcDNAlibraryin

yeastone-hybridsystem．Yeastone-hybridsystemhasbecomeanimportantefficientmethodtoinvestigateDNA-proteininterac-tionandfunctionoftranscriptionfactor．Inthisreport，geneexpressioncDNAlibraryfusedtoactivationdomainofGal4pwasconstructed．LibrarywasinvestigatedusingW-boxcis-elementinyeastone-hybridsystem．Asaresult，4positivecloneswere

found．ThestudypavedafoundationforscreeningWRKYproteinwhichinteractedwithW-boxcis-element．

Keywords：Soybean；cDNAlibrary；Yeastone-hybrid

hybridsystem）是借酵母单杂交体系（yeastone-通过观察酵母细胞鉴酵母双杂交体系的基本原理，

内报告基因的表达状况，研究DNA-蛋白质之间的相互作用。该方法已被广泛应用于寻找与目的DNA片段相互作用的蛋白质分子，特别是在检测特定转录因子与顺式作用元件互作的敏感性和可靠性方面具有独特优势，成为克隆与靶元件特异结合

［1］

的转录因子基因（cDNA）的有效方法。在酵母单

省略了在酵母双杂交体系中采用的杂交体系中，

BD-X蛋白质杂交体，将GAL4的DNA结合结构域置换为文库蛋白编码基因，只要其表达的蛋白能与目的基因相互作用就会启动下游报告基因的转录。从而捕获具有与该元件特异结合的结构域的蛋白［2-3］

。该体系也适用于研究参与转录抑制和DNA质

［4］

复制过程的蛋白质。在研究DNA与蛋白质相互

酵母单杂交体系主要用于确定已知DNA作用中，

与蛋白质之间是否存在相互作用，分离编码结合于目的顺式元件或其他短DNA结合位点蛋白的新基因和定位已经证实的具有相互作用的DNA结合蛋白的DNA结合结构域。迄今为止，应用酵母单杂交体系已经识别并验证了许多与目的DNA序

［5-7］

。本研究利用大豆根cDNA文列结合的蛋白质

为进一步利用酵母库构建了融合表达cDNA文库，

单杂交方法筛选与DNA序列特异结合的蛋白奠定基础。

1

1．1

材料与方法

材料

大豆根cDNA文库由Invitrogen公司合成，库容

9

量5×10cfu（colonyformingunits），平均插入片段长

P，度1500bp，载体为pSPORT-具有Gateway系统

attB2重组位点和氨苄青霉素（AMP）抗性的attB1、

选择标记；大肠杆菌E．coliDH5\"（用于感受态细胞制备）；质粒载体pPC86：酵母细胞表达载体，具有

AMP抗性选择标记，色氨酸合成酶（Trp1）、用于构为本实验室所存。建融合表达cDNA文库，

1．2方法

1．2．1融合表达cDNA文库的建立及扩增将pPC86载体质粒分别用内切酶NotI和SalI进行处理，

·mL－1；将处电泳后回收，用无菌水溶解至终浓度50#g

理好的载体同回收的文库插入片段进行连接（图1）。连接体系（20#L）：处理好的pPC86载体质粒

12-11收稿日期：2012-002）；哈尔滨科技创新人才研究专项资金（RC2011LX002004）。基金项目：国家转基因生物新品种培育重大专项（2011ZX08004-），mail：qxhappyforever@126．com。第一作者简介：刘清醒（1987-女，在读硕士，主要从事植物遗传学研究。E-

166大豆科学2期

2#L，ligase1#L（0．5U），10×文库回收片段6#L，buffer2#L，ddH2O9#L。16℃温育6h，将连接产物全部电激转化大肠杆菌E．coliDH10B感受态细胞，

150r·min－1加入SOC培养基，于小三角瓶中37℃，

培养1h。取3mL接种在100mL2×LB液体培养

230r·min－1过夜培养。当OD600值为1．3基中28℃，

10000r·min－1离心15min后收集菌体；弃上时，

清，加入100mL2×LB（含甘油12．5%）悬浮，分10mL一份于－80℃保存备用。取上述建立的融合表达cDNA文库菌液4mL接种于250mLLB液体

－1

25#g·mL－1Chl）中，培养基（50#g·mLAmp，

28℃，230r·min－1培养6h。当OD600值约为0．8时，收集菌体，提取质粒。

行酶切和测序鉴定。把融合表达cDNA文库质粒转

10，50，200#L转化酵母菌株yWAM2中。分别取5，

－

Leu－固体选择培养基上，30℃培养化液涂到Trp，

－

48h，Trp－，Leu－计数。将其余转化细胞涂到His，

30℃培养3d。待酵母长出后，固体选择培养基上，

－

Trp-，挑取酵母单菌落进行鉴定分析。将在His，

Leu-固体选择培养基上生长的克隆提取质粒后电激

SalI酶切分转化E．ColiDH5α，提取质粒，用NotI，

析，将选取的克隆质粒转化含诱饵载体的pRSW8

-Leu-固体选择培养基和酵母菌株。并分别在Trp，

His-，Trp-，Leu-固体选择培养基划线培养，酵母质粒的提取和酵母转化方法同上。

2

2．1

结果与分析

图1融合表达CDNA文库的构建

Fig．1SchemicillustrationoftheCDNAlibrary

1．2．2诱饵载体的构建将穿梭载体pRS315分别用XbaI和BamHI进行酶切处理，酶切完全后回收。酶切后的pRS315载体与磷酸化、退火后的W-box连接（图2）。连接体系（10#L）：pRS315质粒20ng，W-box30ng，ligase0．5#L（0．5U），10×buffer1#L，ddH2O5．5#L。16℃温育6h，取上述连接产物1．5#L电激转化大肠杆菌E．coliDH5\"感受态

－1

细胞后涂布于固体LB培养基（50#g·mLAmp）37℃倒置培养过夜。上，

融合表达cDNA文库插入片段、文库容量的

鉴定

为检测文库质量，将建立的融合表达cDNA文库提取质粒（随机挑取20个单菌落培养后提取质粒酶切（NotI和SalI）鉴定转化效率和片段插入情况，结果表明插入片段大小为1．0～2．5kb，插入率为90%（图3）。

M：1000bpDNALadder

，SalⅠ图3构建的融合cDNA文库的NotⅠ酶切检测

Fig．3cDNAclonesdigestedbyNotⅠandSalⅠ

图2诱饵载体的构建

ig．2Schematicillustrationofthebaitvectorconstruction

2#L涂板从扩增的融合表达cDNA文库中取1，

8

记数，经测定，表达cDNA文库的滴度为2．7×10cfu。2．2诱饵载体的构建

随机挑取10个菌落，摇菌用PvuⅡ和BamHI

8号有200bp条带，进行酶切鉴定，发现5号、初步

证明片段已插入并将其测序，对测序结果分析后证明8号克隆酶连正确（图4）。

1．2．3

利用酵母单杂交方法筛选cDNA文库将

构建好的诱饵载体转化酵母感受态细胞。挑取酵

－

母单菌落接种到3mLLeu液体选择培养基中，28℃250r·min－1培养36h；10000r·min－1，离心15s收集1．5mL酵母菌液；用200#L酵母质粒提取缓冲液重悬细胞，加约等体积的玻璃珠（直径0．45mm）涡旋震荡1min；再加200#L的酚涡旋1min，10000r·min－1，离心5min；取上清，加1/10体

4℃离心积的NaAC和等体积的异丙醇，混匀后，

10min，10000r·min－1，弃上清，用80%的乙醇洗一次，离心3min，干燥后加10#L灭菌水溶解沉淀，取1#L诱饵载体质粒电激转化E．coliDH5α；提取质粒进

M：1000bpDNALadder

BamHⅠ酶切检测图4构建诱饵载体的PvuⅡ，

Fig．4BaitvectordigestedbyPvuⅡ、BamHⅠ

2．3

融合表达cDNA文库的筛选

用酵母单杂交方法先后3次对cDNA文库进行

HY1-3，HY5-2，了筛选，得到了4个阳性克隆，

2期刘清醒等：利用酵母单杂交方法筛选大豆根融合基因表达cDNA文库167

HY22-2和HY23-2。将这4个克隆分别转化含诱饵

－

载体的pRSW8酵母菌株，结果pRSW8酵母在Trp

－－

Trp－和Leu－选择培养和Leu选择培养基和His、－－

基上均生长；对照在Trp和Leu选择培养基生长

－

Trp－和Leu－选择培养基上不生长而在His、菌落，

菌落，进一步证明筛选的克隆为阳性克隆。

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3讨论

酵母单杂交技术是一种体内鉴定DNA与蛋白

［8-9］

。本研究构建了与酵母单杂质互作的有效方法

交系统中Gal4p的激活结构域融合的表达cDNA文

5

库，一般文库滴度达到1×10cfu以上为有效文库，

8

本研究文库滴度为2．7×10cfu，随机PCR检测表明文库重组率为90%；片段插入长度为1～2．5kb，符合优良文库标准。通过酵母单杂交的方法，从大

box相互作用豆根的cDNA文库筛选到了4个与W-的阳性克隆，为进一步研究大豆中与靶基因启动子

的顺式作用元件特异性结合并相互作用的WRKY蛋白奠定了基础。

转录因子是真核生物基因表达的重要因激活或抑制靶基因的表达，在植物生长发育过子，

［10］

WRKY转录因子程中起到了重要的作用，

是近年来在植物中发现的N-端含有WRKYGQK高

调节启动度保守氨基酸序列的新型转录因子，

box元件基因的表达，子中含W-从而参与植物的各［11-12］

。迄今为止，种防卫反应研究者们已经分别在

拟南芥、水稻、大豆和欧芹中利用酵母单杂交系统

［13-16］

。Liu等发现了新的WRKY类转录因子基因

利用酵母单杂交系统证明拟南芥的WRKY18、WRKY40和WRKY60转录因子与脱落酸相应基因ABI4和ABI5启动子区域中的W-box相互作用，初

步阐明了WRKY蛋白介导的ABA信号转导机［17］

制。Suttipanta等研究表明长春花的WRKY1转

［18］

录因子参与了萜类物质合成代谢的。植物的植物逆境胁迫和生长发育的是涉及受

［19］

体蛋白、激酶、转录因子的协同作用的复杂过程，本研究拟以WRKY转录因子特异结合的特定顺式

box为诱饵［20］，元件W-利用酵母单杂交系统克隆与

之结合的WRKY转录因子，为进一步研究大豆逆境胁迫和生长发育的奠定了理论基础。参考文献

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